miR-181b与炎症关系实验教程分析.ppt

MiR-181b and NF-KBIn vitro and in vivo study 2014-9 Chen yu 细胞实验一：miR-181b对HUVEC功能影响1、TNF-α影响miR-181b表达 (A) Real-time qPCR analysis of miR-181b in response to TNF-α (10 ng/ml) in HUVECs. 短时间作用 不同时间点作用 2、TNF-α作用下，miR-181b影响HUVEC粘附因子表达 蛋白、mRNA、 细胞上清 三个层面证明 ICAM-1、VCAM-1、E-selectin是影响ECs与WBC粘附的主要分子 3、TNF-α作用下，miR-181b影响细胞粘附 细胞实验二：miR-181b靶点的确定1、TNF-α(+)(-)，WB筛查靶点 只使用了miR-181b-m及对照 2、荧光素酶报告系统实验 1、仅使用miR-181b ；2、载体使用浓度梯度 3、用真核细胞表达载体将miR-181b导入细胞 3、miR-181b与靶点结合区域的确认 (D) Normalized luciferase activity of a reporter containing 3′ UTR of importin-α3, predicted miR-181b–binding sites, or mutated miR-181b–binding sites. The reporter was cotransfected with either pcDNA3.1 empty vector or pcDNA3.1–miR-181b. *P 0.05. 4、miRNP-IP分析靶点mRNA富集 (E) miRNP-IP analysis of enrichment of importin-α3 mRNA in HUVECs transfected with miRNA negative control or miR-181b mimics. *P 0.01. 细胞实验三：miR-181b对下游通路的作用1、荧光素酶报告系统检测miR-181b对NF-κB及VCAM1影响 TNF-α(+)(-)条件下，HUVECs中miR-181b对 NF-κB活性及VCAM1promoter活性的影响 2、miR-181b通过作用于靶蛋白影响NF-κB活性 (F) Luciferase activity of reporters containing the NF-κB concatemer in cells transfected with miRNA negative control or miR-181b mimics in the absence or presence of importin-α3 gene lacking its 3′ UTR. *P 0.05. 3、miR-181b对HUVECs NF- κB活性的影响 4、TNF-α(+)，miR-181b影响NF-κB下游mRNA表达 瞬时转染 稳定转染 3、对下游蛋白表达的影响 In vivo 1：miR-181b对粘附因子表达的影响①VCAM-1 mRNA及蛋白水平检测 尾静脉注射，瞬时转染 ②VCAM-1组织原位杂交 ③组织水平确定miR-181b靶蛋白