L10抗体工程制药教程分析.ppt

杂交细胞 骨髓瘤细胞和脾细胞融合后，可产生三类融合杂交的细胞： 骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞 脾细胞-脾细胞 骨髓瘤细胞-脾细胞（即可增殖，又能分泌抗体） 单抗制备步骤 抗原的制备； 动物的选择； 免疫：如脾内一次免疫（在脾内注入抗原，一定时间后，取脾细胞，单细胞） 骨髓瘤细胞培养： 融合；培养 可分泌特异性抗体杂交瘤细胞的筛选： 人单克隆抗体制备难题 人-人杂交瘤技术：由于伦理学的问题，难于获得人的B淋巴细胞的获得是不允许的，且人的骨髓瘤细胞性能不好，技术上仍未突破； 人-鼠杂交瘤技术：小鼠的骨髓瘤细胞和人的B淋巴细胞融合所获得的杂交瘤，可产生人的单克隆抗体。并可在体外长期产生。 关键问题是这种杂交瘤在体外传代8周至6个月后，停止分泌人的单克隆抗体。 2.3.2 多克隆抗体 用抗原免疫动物后所获得的免疫动物的血清均为多克隆抗体。 通常一个抗原分子具有多个抗原决定簇，不同的抗原决定簇能刺激不同的B淋巴细胞而产生针对不同决定簇的抗体。这种由不同的B淋巴细胞克隆所产生的抗体称为多克隆抗体。 抗原决定簇：与抗体或淋巴细胞上受体特异结合的抗原部分（分顺序决定簇，即多肽链上相邻的氨基酸构成；构象决定簇，肽链上相距较远的一些氨基酸残基通过分子折叠而成的特定结构）。 单克隆和多克隆抗体的比较和用途 特异性 敏感性 均一性 McAb PcAb 低 差 无 高 强 有 1、用于免疫学检测，辅助临床诊断 2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原 3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等 4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。 应用：临床检测、抑制器官移植排斥、治疗自身免疫疾病、生物导弹等 2.3.3 基因工程抗体和抗体工程 将制备单克隆抗体的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合； 对编码蛋白质基因加工改造，重新组装，转染适当的受体细胞后表达出抗体分子。 这种经基因重组的抗体称为基因工程抗体，或重组抗体（recombinant antibody) 抗体研究进展3个阶段： 　①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体； 　②1975年杂交瘤技术单克隆抗体； 　③1994年基因工程抗体； 基因工程抗体种类 2.3.3.1 噬菌体抗体库技术的基本方法 1）获取目的基因 2）抗体库技术的载体 3）淘筛 4）表达与鉴定 噬菌体抗体库技术的特点 1）模拟天然全套抗体库 2）避开了人工免疫和杂交瘤技术 3）可获得高亲和力的人源化抗体 2.3.3.2 基因工程抗体表达 1）原核细胞表达 2）真核细胞表达 3）转基因植物表达 4）转基因动物表达 2.3.3.3 基因工程抗体的生产技术 从杂交瘤细胞或免疫脾细胞、周围血淋巴细胞中提取抗体基因所对应的总RNA，逆转录成cDNA； 经PCR扩增出抗体的重链基因和轻链基因； 按一定的方式将轻链基因和重链基因克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子； 筛选出高表达的细胞株，生产； 纯化抗体。 鼠单克隆抗体的人源化 目的：克服鼠源单抗的免疫原性，逃避人体免疫系统的识别，避免诱发HAMA反应。 抗体的人源化应保持或提高抗体的亲和力和特异性，并降低或消除抗体的免疫原性。 恒定区人源化，可变区人源化（但发现可变区还必须保持鼠源性残基，以提高亲和力） 人-鼠嵌合抗体 设计用人抗体的C区代替鼠抗体的C区，可大大减少鼠源性单抗的免疫源性。保存完整的鼠单抗的可变区（V），使其亲和力和特异性得到保证。 人-鼠嵌合抗体制备步骤 克隆鼠源性VH（可变区重链）基因和VL（可变区轻链）基因； 选择合适的人C区基因； 载体的选择；质粒或噬菌体、粘性质粒等。主要采用哺乳类动物细胞表达载体。并应含有原核基因序列，使之能在细菌中繁殖。 嵌入抗体的表达：采用磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖介导法、电穿孔法或微注射法等。 嵌合抗体的检测：ELISA，Western印迹法等。 嵌合抗体技术 人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。 嵌合抗体技术 嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区 人鼠源性抗体高变区人抗体 双特异性抗体 一个抗体上有两个不同的抗原结合位点，可同时与两种不同的抗原簇结合。这样就可以与酶、同位素、或药物、毒素等偶联，并将其带到靶点发挥希望的功能。 制备方法： 化学偶联法； 杂交-杂交瘤法； 基因工程法； 抗体融合蛋白 抗体基因的一部分被非抗体序体所替代