高蛋白海洋酵母的分子生物学鉴定精要.pptVIP

Page ? * 高蛋白海洋酵母的分子生物学鉴定 主要内容： 1、简介 2、 18S rRNA基因及ITS鉴定方法 3、鉴定结果 4、结论 * 简介 一、PCR 聚合酶链式反应（PCR），是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 * 二、18S rRNA 及ITS序列 在 rDNA?基因中，5.8S rDNA 和 28S rDNA 基因间隔序列称为(ITS)，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行 RFLP（限制性内切酶片段长度多态性） 或序列分析，可用于对细菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。甚至用于区分关系非常近的种。 * 在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5’到3’依次为：外部转录间隔区( external transcribed spacer,ETS) 、18S基因、内部转录间隔区1 ( internal transcribed spacer , ITS1 ) 、5. 8S基因、内部转录间隔区2( ITS2 ) 、28S基因和基因间隔序列( intergenic spacer, IGS)。核糖体DNA中的18S、5. 8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守,在生物种间变化小,而内转录间隔区ITS1 和ITS2作为非编码区,承受的选择压力较小,相对变化较大,并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性。 * 方法 18S rRNA基因鉴定及ITS的鉴定 (1)酵母DNA微量制备 (2)PCR (3)PCR产物的检测 (4)序列比对 (5)18S rRNA及ITS的序列的系统发生分析 * 18S rRNA基因鉴定 (1)酵母DNA微量制备 1、在250ml三角瓶中用50mlYPD培养液在28℃条件下培养细胞过夜。 2、取5ml培养物移入离心管中。2500r离心5min，弃去上清液。 3、用0.5ml 1M山梨醇0.1MNa2EDTA(pH7.5)悬浮细胞转移至1.5ml小离心管中。 * 4、加0.02ml 10mg/ml蜗牛酶溶液，在37℃水浴锅中水浴60min。 5、2500r离心1min，弃去上清液。 6、去上清，在0.5ml的50mM Tris-HCl(pH7.4)--20mM Na2EDTA中悬浮细胞。 7、加0.05ml的10％十二烷基磺酸钠(SDS)，混匀。 * 8、置65℃保温30分钟。 9、加0.2ml 5M乙酸钾，在冰浴中放置1h。 10、9000r离心5min。 11、将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积的饱和酚，轻轻混匀。 12、8000r离心1min。 * 13、取上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)室温下放置几分钟。 14、8000r离心1min。 15、取上清水相，加入0.1体积的3M乙酸钠，2倍体积的乙醇，-20℃过夜。 16、9000r离心5min。 17、自然干燥，将沉淀物悬浮在0.5ml TE缓冲液中(pH 7.4) * (2)PCR 1、引物：PCR扩增18S rDNA采用真菌18S rDNA扩增通用引物。 上游引物：5’--ATCTGGTTGATCCTGCCAGT--3’ 下游引物：5’--GATCCTTCCGCAGGTTCACC--3’ * 2、反应体系 100 μl PCR反应体系如下： Buffer 10μl dNTP 8μl 引物 2μl+2μl 模板 2μl ddH20 75.5μl Tag酶 0.5μl * 3)反应条件 初始变性：94℃ 10min 变性温度：94℃ 1min 退火温度： 53℃ 1min 延伸温度： 72℃ 2min 最后延伸： 72℃ 10min 共35个循环。 * (3)PCR产物的检测 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，观察PCR扩增是否成功，交由上海生工测序。 (4)序列比对 通过以上方法得出的18S rDNA序列从NCBI上通过BLAST分析与已知序列比对 (http：///BLAST)， * (5)18S rDNA的系统发生分析 系统发生树通过3.75c版本的PHILIP软件构建。距离矩阵根据Kimura的二参数模型通过DNADIST程序产生。用PHYLIP软件包的邻接程序分析数据之间的Neighbour-joining。海洋鞭毛虫的18S rDNA序列作为18S rDNA