基因操作的主要方法和工具分析.pptx

第2章 基因操作的主要方法和工具－1;1. 分子生物学基本知识;真核生物基因组：;Zea mays （玉米） 8,000 Homo sapiens 3,000 Oryza sativa（稻） 400 Drosophila melanogaster 165 Arabidopsis thaliana（拟南芥） 100 Saccharomyces cerevisiae 12 E.coli 4.6 ;什么是C 值？ 通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量.;;近年来完成的原核生物和真核生物的基因组测序揭示，在一些最基本的生命特征方面，地球上所有生物可分为三大类群，即真细菌(bacteria)，古细菌或古生菌(archaea)和真核生物(eukarya)三界(domain)。;1.3 基因组进化的分子基础;转座子的发现;转座子可以分为两大类： DNA-DNA方式转座的转座子： 反转录转座子(retrotransposon)：在结构和复制上与反转录病毒类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。 ;转座子转移; 已知的转座因子的转座途径有两种： 复制转座和非复制转座。 复制转座：转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座因子。 非复制转座：转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上，结果是在原来的位置上丢失了转座因子，而在插入位置上增加了转座因子。;1.4 新基因产生的主要方式： ①基因加倍之后的趋异，这类基因基本保持原有的基因功能,但往往获得了新的表达模式,这是新基因产生的主要方式。酵母基因组在1亿年前经历了一次完全的加倍;②外显子或结构域洗牌（domain shuffling or exon shuffling):功能域或外显子洗牌由不同基因中编码不同结构域的片段彼此连接形成的全新编码序列。它们有一个全新的结构组合，可为细胞提供完全不同的生物学功能。 不同的结构域加倍或重组,产生具有创新功能的基因.真核生物约19％的基因产生于外显子洗牌。 ;③可移动元件的转座和逆转座。 ④外源基因水平转移。 原核生物中DNA的水平转移是一种十分普遍的现象，可通过接合转移、噬菌体转染、外源DNA的摄取等不同途径发生。 大多数有关动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转座成分。 ⑤基因裂变(fission)和融合(fusion)，由一个基因分裂成两个不同的基因，或两个或多个基因融合组成一个新的基因，原核生物约0．5％的基因由此产生。 ⑥非编码序列转变为编码序列。 ?? ;基因之间的同源性： 直系同源（ortholog）：不同物种，同一祖先，功能相同。 旁系同源（paralog）：同一物种，复制产生，功能可能不同。;1.5 分子钟 单位时间内同源蛋白质氨基酸顺序或DNA核苷酸序列发生改变的比率称为分子钟，通常以百万年发生单个代换为计算单位，可用于估算祖先序列演化的时间，确立系统发生树的进化年代。;2. 核酸操作2.1 核酸的分离和检测DNA, RNA——提取、分离与纯化——重要的第一步;(1) 核酸的分离、提取通则;(1.1) 破碎细胞 ;(1.2) 酶处理 ;(1.3) 核酸的分离与纯化 ;①酚提取/ 沉淀法 ;核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩;②层析法 ;;全自动核酸分离纯化系统 ;(2) 核酸定量;分光光度计;Thermo Scientific NanoDrop 2000c(March 2, 2009) ;（3）核酸质量鉴定;（4） 核酸的凝胶电泳 ;涌动率决定因素：分子大小，空间构型，电荷数。 涌动方向;PAGE;（5） 核酸样品的保存 ;(6) 核酸的检测;核酸杂交;①核酸的膜杂交;核酸杂交的基本过程;电泳：凝胶电泳分离酶切DNA混合物;DNA变性：获得单链DNA转膜 ：将核酸样品转移到支持膜上(硝酸纤维素膜、 尼龙膜) ;;C. 杂 交;D. 漂洗、检测;;;;;斑点杂交——耗时短 ;菌落原位杂交筛选目地基因;②原位杂交;探针的制备－核酸标记;标记物;探针标记方法;切口平移法：Dnase I产生切口－DNA 聚合酶I加入标记物。标记强度高。 ;引物延伸标记法：模板——核酸分子变性，与引物退火，聚合酶催化延伸反应。用标记的NTP作为底物。所有的核酸序列都有标记，标记强度高。 ;2