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实验二 蛋白质浓度测定――双缩脲法 目的要求 学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2＋形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，故可用来测定蛋白质的浓度。 试剂和器材 一、测试样品 ⒈ 标准蛋白溶液 10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05M氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。 ⒉ 测试样品液 人（鸭）血清（稀释10倍）。测定其它蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。 二、试剂 双缩脲试剂：将0.175g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加30ml浓氨水，30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置1－2小时，再以蒸馏水定容至100ml后，摇匀，备用。 三、器材 试管、试管架、恒温水浴、752型分光光度计 操作方法 标准曲线的绘制 取6支干试管，按下表操作。 0 1 2 3 4 5 标准蛋白液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白浓度 (mg/ml) 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 蒸馏水 （ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 双缩脲 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 充分混匀后，室温下（20－25℃）放置30分钟 测A540值 以A540为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。 二、样品测定 取2支试管，按下表操作。 试管 0 1 血清稀释液（ml） 0 0.5 蒸馏水（ml） 1.0 0.5 双缩脲（ml） 4.0 4.0 充分混匀后，室温下（20－25℃）放置30分钟 A540 三、计算 血清样品蛋白质含量（g/100ml血清）＝×10－3×100 固体样品蛋白质含量（％）＝×100％ 其中，Y为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/ml），N为稀释倍数，V为血清样品所取得体积（ml），c为样品原浓度。 注意事项 本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验测定范围1－10mg蛋白质。 须于显色后30分钟内比色测定。30分钟后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 有大量脂肪性物质存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。