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RNA干扰技术研究bcr/abl基因 温倩宇 RNA干扰 RNA interference，RNAi RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性基因沉默的现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵，调控基因表达的监控机制，有重大生物学意义。 RNAi作用机制 基因沉默 转录水平的基因沉默（TGS）：转基因在细胞核内RNA合成受到阻止而导致基因沉默。 转录后水平的基因沉默（PTGS）：转基因能在细胞核内稳定转录，但在细胞质内却无相应的mRNA。 目前认为RNAi属于PTGS dsRNA介导的同源性靶RNA降解过程 第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RnaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA( small interfering RNA siRNA) 第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。 RISC由多种siRNA,解旋酶，ATP，核算内切酶，核酸外切酶等多种成分组成。 第一步 第二步 RNAi技术的一般研究路线 （一）siRNA的设计 RNAi目标序列的选取原则 ①从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 ②将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，或者小鼠，大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。 ③选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 1.化学合成 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 （二）siRNA的制备 2.体外转录 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法――制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200―1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNA“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗 4. siRNA表达载体 siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究――带有抗生素标记的载体可以在细