第五章酶分子修饰分析.ppt

Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule 酶分子修饰的产生 酶在生物技术与工程中占有十分重要的地位。酶所具有的反应专一性、催化高效性及反应条件温和等优点，使其广泛应用在工业、农业、医药、环保及能源等领域。 由于酶的本质是蛋白质的特点，在催化反应中受到稳定性、反应条件等制约，早期能大规模应用的酶还不够多，酶工艺也不完善。 酶在使用中的缺陷有：稳定性差、活力不够高、抗原性等，如对酸、碱、重金属、有机介质、高温等物理化学环境敏感，且活性、专一性、作用条件不能满足生产工艺要求。 酶分子修饰成为酶工程中具有重要意义和应用前景的领域。 随着蛋白质工程的兴起与发展，酶分子修饰与基因工程技术结合在一起，使酶分子修饰展现出更广阔的前景。 Contents of chapter 5 5.1 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 酶分子修饰的意义 提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure 5.2 酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须对修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 了解： （1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。 酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例 5.3 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰(共价/非共价) 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 酶分子的物理修饰 第一节 金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。 有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 一、金属离子置换修饰的方法 1、酶的分离纯化 2、除去原有的金属离子：加入金属螯合剂 3、加入置换离子 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 二、金属离子置换修饰的作用 阐明金属离子对酶催化作用的影响 提高酶活力 （а-淀粉酶） 增强酶的稳定性（Mn-SOD） 改变酶的动力学特性 第二节 大分子结合修饰 定义：利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。简称为大分子结合法。 常用的修饰剂：右旋糖酐（dextran）、聚乙二醇（PEG）、肝素(heparin)、蔗糖聚合物（Ficoll）、聚氨基酸等。 大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修饰方法。 第二节 大分子结合修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 第二节 大分子结合修饰 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 一、大分子结合修饰的方法 1、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖