酶工程亲和层析分析.ppt

五、 亲和层析 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography） 7. 亲和层析方法 根据欲分离组分与配基的结合特性, 亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 (1) 共价亲和层析 共价亲和层析是生物大分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种分子分离方法。 具有共价反应活性的巯基亲和层析剂可用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为母体。通过溴化氰( BrCN ) 活化, 先后用谷胱甘肽及2’,2’ -吡啶基二硫基化合物处理, 而得到谷胱甘肽型巯基层析剂。 (2) 疏水层析 酶蛋白通常含有疏水性较强的氨基酸, 如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等。采用氨基烷烃与BrCN 活化的琼脂糖进行反应, 就可形成改性的琼脂糖。酶蛋白可以与亲和层析剂上改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应, 而得以分离。 将一系列长度不同的碳氢化合物接到琼脂糖载体上, 从而得到一系列相应的疏水性琼脂糖层析剂, 可用它们分离纯化某些酶和蛋白质。 疏水亲和吸附通常在高浓度盐溶液的条件下进行。通过逐步降低盐浓度, 可以将疏水吸附的组分洗脱出来。 环境的温度和pH值对疏水吸附和洗脱都有影响, 要根据情况进行必要的控制。 (3) 金属离子亲和层析 蛋白类酶和其他蛋白质表面的某些氨基酸残基, 如组氨酸的咪唑基团, 半胱氨酸的巯基, 色氨酸的吲哚基团, 可与金属离子亲和结合。 用螯合剂可以将金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等) 鳌合到母体(如交联化的琼脂、葡聚糖等) 的表面上制成金属亲和层析剂。 将金属亲和层析剂装进层析柱, 浸泡平衡, 洗涤后, 将含有酶等生物活性物质的样品柱上, 与金属配基有亲和力的分子都将被留在柱内, 其余组分则流出柱外。 洗脱： 可通过改变盐的浓度,或改变pH值等降低金属离子和蛋白质之间的亲和常数的方法。 或用竞争性试剂, 如咪唑、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等, 将蛋白质置换下来。 洗脱方式：分级洗脱或梯度洗脱方式 主要优点： 可用不同的金属离子结合到螯合载体上,并可用一种更强的螯合剂将所使用的金属离子洗脱下来, 从而实现母体的再生。 螯合剂较稳定, 金属的亲和特性不会大幅下降。通过选择适宜的金属离子, 可实现蛋白质和配基之间的不同吸附。在大多数情况下, 从亲和层析柱上洗脱下来的酶, 仍然具有生物活性。 (4) 免疫亲和层析 抗原和抗体是一种生物分子对, 它们之间具有高度专一的亲和力。用适当的方法将抗原(或抗体) 结合到母体上, 制成亲和层析剂, 便可用来高效地分离和纯化与其互补的抗体(或抗原)。 免疫亲和层析又称为抗体亲和层析, 除了可以采用抗原或抗体作为配基以外, 通常还采用用蛋白A 或蛋白G 作为配基使用。 蛋白A 或蛋白G 对于各种来源的免疫球蛋白Ig G 的Fc 区域都具有高度专一的亲和性, 与各种母体(如琼脂糖等) 结合后, 广泛作为亲和层析剂使用。 蛋白A 是从金黄色葡萄球菌中得到的一种相对分子质量为42 000 的蛋白质。蛋白A 分子的6 个区域中, 有5 个可与Ig G 结合。通常1 分子蛋白A 至少可结合2 分子的Ig G。 蛋白G 是一种细胞表面蛋白, 是Ⅲ 型Fc 受体。蛋白G 对于Ig G 有很强的结合亲和力, 但对白蛋白的亲和结合力较弱。 蛋白A 和蛋白G 对Ig G 的专一性有所不同, 蛋白A 的结合专一性较强, 而蛋白G 的结合专一性较弱, 所以蛋白G 可以与更多的Ig G 亚种结合, 更适应于一般抗体的分离纯化。 (5) 染料亲和层析 一些有机染料, 如蒽醌化合物、偶氮化合物等, 具有类似于NAD+ 的结构。一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶, 对这些染料有一定的亲和力。常用的有机染料是二羟偶氮化合物。 以这些染料作为配基, 共价偶联到纤维素或琼脂糖等母体上, 制得染料亲和层析剂。 已成功地用于以NAD+ 、NADP+ 、ATP为辅酶的多种酶的分离纯化。 (6) 凝集素(lectin) 亲和层析 凝集素是一类能与糖的残基专一而又可逆结合的蛋白质。它们能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞的凝集体等亲和结合。 凝集素亲和层析可以用于各种糖蛋白的分离纯化。 例如, 胞外超氧化歧化酶( ECSOD ) 具有3 种同工酶,