第章生物制品概述.ppt

4.2.1 菌种的选择 抗原性 典型形态，培养特性和理化特性 易于在人工培养基上培养 培养过程中毒性小或无毒力回复 制备类毒素时，在培养过程中产生大量的典型毒素 4.2.2培养基的营养要求 碳、氮源和无机盐等必需外，有时需添加生长因子。 结核杆菌以甘油为碳源，百日咳杆菌需要谷氨酸，胱氨酸为氮源。 4.2.3 培养条件控制 氧分压、温度、pH、避光、渗透压 4.2.4 杀菌 彻底杀死细菌不影响防病效力 4.2.5 稀释、分装和冻干 含防腐剂的NS稀释，无菌分装。 卡介苗疫苗生产工艺 1.简介： 牛型结核杆菌 卡默德和介兰经历13年获得减毒株 2.制备工艺 表面培养 培养温度37-39℃，时间10-12d,生产的卡介苗活力高，用培养6-8d的幼龄苗，有利于制备冻干品。 白喉疫苗的生产工艺 1.简介 1923年Roman制得白喉毒素的类毒素 2.生产工艺 ⑴菌种：高效价毒素，1896年分离的Pw8 ⑵培养产毒 ①产毒培养基：胰酶牛肉消化液培养基 ②培养：深层培养法，温度，pH，碳源 ⑶脱毒 毒素经甲醛加温处理后，去除毒性而保留其抗原性，形成类毒素 ①温度、pH、甲醛浓度及毒素自身的影响 ②脱毒后精制和精制后脱毒 a.原制毒素脱毒 质量稳定，毒素逆转现象少；但含有大量培养基残留物质，进一步提纯有困难，脱毒体积大，不利于操作。 b.精制毒素脱毒 脱毒体积小，工艺紧凑利于操作，且可获得高纯度制品。但易发生毒性逆转现象。 ⑷白喉类毒素的精制 去除细菌代谢的产物及培养基中残留的有机物、无机盐等非特异性杂质，提高白喉类毒素的纯度，降低接种副反应。 活性炭、硫酸铵分段沉淀法 5核酸疫苗 概念 它是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA）与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。 发展历史 1990年Wolff等偶然发现给小鼠肌肉注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。 1991年Willams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。 1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。 核酸疫苗的制备 ⑴核酸疫苗的构建 ⑵工程菌的发酵：深层液体培养 ⑶菌体细胞的收集和细菌裂解 菌体收集：离心 细菌裂解：煮沸法、SDS裂解法等 ⑷质粒的初步抽提 变性后成为单链环状DNA,将溶液的pH调回中性时，容易复性并溶于液相 ⑸质粒DNA的纯化 去除细胞碎片、蛋白质、脂类物质和RNA ⑹质粒的浓缩：乙醇沉淀 ⑺核酸疫苗的质量监控 ①浓度测定 ②纯度测定 ③限制性内切酶图谱分析 影响核酸疫苗效果的主要因素 ⑴质粒载体的骨架结构 ⑵给药剂量和导入细胞的效率 ⑶抗原蛋白在宿主细胞的表达效率 ⑷免疫次数、注射方式和给药途径 核酸疫苗的接种方法 ⑴直接注射法 ⑵基因枪轰击法 ⑶细菌或病毒携带法 ⑷口服、滴鼻或喷鼻法 muscle DNA疫苗表达抗原 V I II III IV 1 2 gene (DNA) RNA antigen(protein) 基因指导其编码抗原的产生 抗原激活免疫反应 产生抗体 细胞免疫 DNA疫苗特性 表达病毒抗原的抗原性与观察的自然感染相类似 有效激发CD8+ ，CTLs （经MHC I 提呈） 多种表达质粒混合接种表达多组分、多个抗原 核酸疫苗优缺点 优点 无需纯化蛋白 持续表达蛋白 用核心蛋白保守DNA制备核酸疫苗 稳定性好，生产、使用、运输方便 体液免疫、细胞免疫 构建多价疫苗 缺点 免疫反应弱 表达水平不理想 免疫耐受 整合到染色体（变异） DNA用量 10 mg plasmid DNA i.m./i.d./gene gun 10-50 mg plasmid DNA i.m./i.d./gene gun 100mg plasmid DNA i.m. 进入临床试验的DNA疫苗 HIV-1 (env,rev,gag,pol, nef) HSV-1 (gD,gB,ICP-27) Malaria parasite (CSP) Influenza A virus (HA,M1,NP) HBV (HBsAG) tumour vaccines (tum