临床微生物学检验技术.概要.ppt

使用铅笔在磨砂面上标记 轻轻打开盖子 挑取标本中脓样或可疑部分 按照模板，从椭圆形中心开始，从里→外→里，反复多次涂抹，稍晾，待痰膜水分挥发部分，视痰膜厚薄程度，再次挑取适量痰液，涂至满意为止（循环覆盖） 水样痰的涂法 可用反复多次覆盖法，实在挑取不到什么东西，先用吸管吸取适量标本（标本一定要静置），稍晾（时间较长），再用竹签涂抹均匀致满意 涂抹完的标本自然干燥后，再火焰固定（5秒内来回4次） 3.固定 涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。 固定目的：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。 背面冲洗 1.原理  （1）革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。  （2）革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。  （3）革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。 ③滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒 钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉 的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流 下的酒精无色为止（约需30s）， ④滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细 流水冲洗。 （3）标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏 油后用油镜观察。 革兰染色的医学意义 ： 1、可以协助鉴定细菌 2、为临床使用抗生素提供依据 3、有助于了解分析细菌的致病性 影响因素 1、操作因素 2、细菌因素 3、染液因素 操作因素 1、涂片太厚 在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。 　 　　。 2、脱色时间 阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。 3、固定方法 固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。但在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果 细菌因素 细菌培养时间 细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发 生 变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。 　　 染液因素 1、碘液 碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。 　　2、结晶紫 结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。 　　 3、酒精 酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95% ，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度为70% 时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。 抗酸染色法acid－fast staining method 　 1882年由埃利希（F．Ehrlich）首创并经F．齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。其中最具代表性的为对结核菌的齐尔-尼尔森（Ziehl－Neelsen）染色法和齐尔-加贝特（Ziehl－Gabbet）染色法。用石炭酸复红染色后，用盐酸乙醇分色，再用美蓝进行对比染色，即不再脱色而呈现石炭酸复红的红色。 改良抗酸染色 1、将5%石碳酸复红800C浸泡20分钟，不加热，其余同上。 2、冷染色法。时间 3、荧光染色法 ①涂片。同抗酸染色法。?②荧光染色。取标本涂片滴加荧光染液金