第三章转基因动物技术与药物生产技术分析.ppt

6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 利用反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高基因转移的效率。因此可以利用反转录病毒作为目的基因的载体，通过感染实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交，筛选即可获得转基因动物 反转录病毒感染法? 6.3 转基因动物 脂质体载体包埋法 6.2 转基因技术 脂质体载体包埋法图示 6.2 转基因技术 生物学方法 基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病毒载体等。 6.2 转基因技术 腺病毒载体 运载DNA片段较大 安全性好 宿主范围广 对受体细胞分裂周期要求不严 外源基因表达高效 6.2 转基因技术 反转录病毒载体 可获得稳定有效的转染 可用于不易转化的细胞 但有免疫反应,转染能力有限 6.2 转基因技术 反转录病毒载体图示 6.2 转基因技术 转染细胞的鉴定 载体的抗药性选择 DNA分子杂交法 6.2 转基因技术 制备转基因动物的方法? 转基因动物研究的核心技术是成功地把目的基因转入动物早期胚胎细胞中。目前，研究生产转基因动物的主要方法有基因显微注射法，胚胎干细胞移植法，反转录病毒感染法和精子载体导入法等。 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 基因显微注射法 6.3 转基因动物 显微注射DNA(目的基因)的构型、末端结构、长度与浓度、克隆载体和溶解DNA的缓冲液对目的基因的转移、整合及表达都有一定影响。 显微注射DNA的制备与纯化 6.3 转基因动物 DNA构型和末端结构： 线状与环状DNA均可用于转基因研究。 线状DNA的末端结构差异(平末端、粘性末端)对整合效率与整合分子的结构影响不大。转移的DNA在染色体上的整合大多呈首尾相连的多拷贝，不同构型与末端间无明显差异。 6.3 转基因动物 载体： 原核克隆载体(如质粒)序列不影响携带基因的整合效率，但影响基因在转基因动物中的表达。注射前去除载体的基因，其表达水平显著高于保留载体的基因，且前者具有较好的重复性。对某些基因(如珠蛋白基因)，只有注射前去除载体才能得到组织特异性表达。 6.3 转基因动物 留在核内的DNA溶液体积不明。 DNA浓度易掌握，1ug/ml-3ug/ml DNA体积与浓度： 6.3 转基因动物 溶解DNA的缓冲液： 一般含5-10mmol/ml Tris(pH7.4)与0.1-0.25mmol/L EDTA EDTA浓度需适中 6.3 转基因动物 鼠的准备与要求 母鼠——卵供体和假孕母鼠 公鼠——正常、结扎 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 卵供体母鼠： 超排卵供体——4～6周鼠 　3—4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂。 　5周以后母鼠产卵逐渐减少。超排卵较好的母鼠每只每次产20—30个卵。 6.3 转基因动物 公鼠 　性成熟约在6—8周，不同种系公鼠性维持时间不一，一般1—2年，但纯系公鼠只可使用8—10个月。每个公鼠需单笼饲养以免咬伤，饲养于2周后方可与超排卵母鼠交配。每个母鼠与1个公鼠交配，次日上午检查精栓，如两次以上都不能使母鼠有精栓，则需更换公鼠。为保证有足够的受精卵，公鼠最好每周只交配1次。 6.3 转基因动物 假孕母鼠 　母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后的养母。这种母鼠在6周至5个月较适宜，体重最好大于20克，已产过仔并成功抚育过仔鼠的假孕母鼠最理想。 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 超排卵与取卵 4—6周母鼠在明暗循环的动物房内饲养3—5天，即可作超排卵，母鼠的性成熟程度是影响其超排卵的主要因素，一般在3—5周，卵泡成熟周期已开始，对卵泡刺激素(FSH)有反应的卵泡数达峰值。母鼠的不同种系其超排卵数也不同，这取决于其对FSH和LH(黄体生成素)的敏感程度，高敏种系每只鼠超排卵数可达40—60个，低敏种系不足15个。 取卵：取卵全过程应尽快完成(1小时内)以减少暴露状态给卵带来的不利因素。 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 需8周以上，无种系要求。在正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要先后使3只母鼠产生精栓且所有产生精栓的母鼠均未怀孕，然后才可用于与母鼠交配，产生假孕母鼠。 结扎公鼠 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 显微注射 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 6.3 转基因动物 卵的转移 6.3 转基因动物 转基因鼠的获得 胚胎干细胞方法 反转录病毒感染法 精子载体法 6.3 转基因动物 胚胎干细胞(