转基因材料的检测重点解读.docVIP

转基因材料的检测 —转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测 摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。 关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号 转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]为保护消费者的知情权和选择权多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%日本是5%等而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识为了适应对转基因产品的标识要求已经建立了一系列的检测方法以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[]。 转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜华农1号以及DNA为模板进行PCR扩增，鉴别转基因材料。1 材料与方法 试剂 1 Mix 4 Mix 体积（μl） 体积（μl） 10×PCR buffer 1 4 25 mM MgCl2 _ _ 5 mM dNTPs mixture 0.4 1.6 10 nmol Primer 1 1 4 10 nmol Primer 2 1 4 20-100 ng/ul Template DNA 2 _ Taq DNA polymerase 0.1 0.4 ddH2O 4.5 18 Total 10 32 μl，分别再加入对应的DNA 2 μl，然后稍作离心，进行PCR。 1.2.2.3 将反应管置于PCR仪中，按表2的反应程序进行PCR扩增 表2 PCR反应的变温程序 阶段 循环次数 温度 持续时间 1 1 94℃ 5min 2 35 94℃ 45s 54℃ 45s 72℃ 1min 3 1 72℃ 7min 4 4℃ 保温 1.2.2.4?制备1.5%的琼脂糖凝胶 1.2.2.5?反应结束后，在反应产物加入2ul 6×Loading Buffer，用微量移液枪小心加入样品槽中，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 1.2.2.6 加完样后，合上电泳槽盖立即接通电源，进行电泳，100 V，20 min。电泳结束后，紫外观察并拍照。 1.3 PCR定性分析的引物 表3 PCR定性分析的引物 （本实验使用的是1,3,4,6,7,8号引物进行PCR扩增[8-9]） 基因名称 编号 引物名称 引物序列 5’-3’ 产物大小 CaMV35s启动子 1 35S-F GCTCCTACAAATGCCATCA 195 bp，邵碧英等,2002;阮小蕾等,2010 35S-R GATAGTGGGATTGTGCGTCA Nos启动子/终止子 2 Nos1-F ATCGTTCAAACATTTGGCA 165 bp Nos1-R ATTGCGGGACTCTAATCATA 3 Nos2-F GAATCCTGTTGCCGGTCTTG 阮小蕾等,2010 Nos2-R TTATCCTAGTTTGCGCGCTA NPT II基因 4 NPT1-F AGGCTATTCGGCTATGACTGG 600 bp，邵碧英等,2002 NPT