- 1、本文档共80页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM) 1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理,光电测量,计算机,细胞荧光化学,单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速(每秒可达1000-10000个)的定量分析和分选(纯度可达99%以上)的技术。 流式细胞仪结构 ? 激光光源及光束形成系统 ? 流动室及液流驱动系统 ? 光学系统:透镜、滤光片、小孔,聚焦光源, 收集不同波长的荧光信号。 ? 信号检测与分析:光电倍增管(PMT)、补偿 电路。荧光信号转换为电信号,并将信号放大。 ? 存储、显示、分析系统:计算机。 ? 细胞分选系统 流式免疫分型技术要点 标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存 FCM的主要测定指标 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4) 其中: FSC:反映细胞的大小 SSC:反映细胞内颗粒性 FCM标记方法 单标: 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC(三参数) 双标: (两种单抗/tube):FL1, FL1, FSC, SSC(四参数) 三/四标: (三种单抗/tube)(四种单抗/tube): FL1-FL3/4, FSC, SSC 荧光素种类 FITC(异硫氰酸荧光素):绿色 530nm PE(藻红蛋白):橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白):深红色 675nm PI(碘化丙啶):橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白):红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发 抗体的选择 PE最强,适用于弱表达抗原 FITC最便宜,适用于强表达抗原,适用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 数据显示方式 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图 流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4 流式常见图形 (Histogram Plot) 流式常见图形 (Dot Plot) 第二节 流式细胞术的科研应用 分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量 流式应用常见范围 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子:CD 系列 细胞浆内分子:胞内细胞因子 细胞核内分子:P53 细胞功能检测:细胞周期、凋亡 抗体标记的方法 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强,适用于弱表达抗原 FITC最便宜,适用于强表达抗原 间接标记:适用范围广, biotin-avidin不适合弱抗原的检测 实验对照的设计 空白对照:ALL 阴性对照:常用同型抗体对照 单色分析:设同型抗体对照 多色分析:同型对照,单阳性对照(用于仪器校正) 阳性对照:检测阴性时 实验标本的处理 单细胞悬液的制备:胰酶消化 抗体或标记分子的染色:抗原抗体反应 非特异结合的去除:洗涤和封闭 封闭:血清和同型抗体 流式检测应用实例 凋亡 细胞内分子检测 凋亡检测-每一步都有检测试剂盒 细胞周期 细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining Caspases Annexin V Assay建议用于悬浮细胞 Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡 流式“TUNEL” Intracellular Cytokine-Protocol SORTING(细胞分选) DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response CBA(Cytometric Bead Array) 第三节 流式细胞术的临床应用 白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数:造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断(CD55、CD59) 血小板活化试验 流式细胞白血病免疫分型 流式细胞的免疫分型 是白血病分型的重要指标 FAB标准,形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断,但不适合用于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD) FCM应用 1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 2、凋亡检测 3、免疫功能的检测 4、血液学应用 5、HLA-B27的检测:用于诊断强直性脊柱炎。 6、其他:溶液中细胞因子的测量。 7、细胞分选 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 1)细胞增殖周期:
文档评论(0)