流式细胞术实验方法及应用介绍.ppt

流式细胞术实验方法及应用 何 玉 萍 一、流式细胞术的原理 近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。 二、流式细胞术的特点、优点 速度快 　　极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。 多参数分析 　　可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。 常用荧光素  常用荧光探针组合 细胞表型分析： 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5 四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染 四、标本的收集、单细胞悬液的制备 骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等 1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备 骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记，再溶血。 2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞) 培养板 吸去培养液 PBS洗2次 胰蛋白酶 37℃，室温，3-5min 含血清的培养基 吹打 PBS洗2次 单细胞悬液。 3. 组织器官单细胞悬液的制备 酶消化法 组织器官 单细胞制备仪 剪碎法 机械法 网搓法 研磨法 （1）、酶消化法 组织块洗去血液 剪成小块 胰蛋白酶 37℃，15-30min 含血清的培养基 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 （2）、机械法 单细胞制备仪 组织块洗去血液 剪成小块 制备仪 2-3min 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 剪碎法 组织块洗去血液 剪至浆状 吸管轻轻吹打 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 网搓法 组织块洗去血液 100目钢筛网轻搓 生理盐水 收集滤液 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 研磨法 组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 100目钢筛网 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS洗2次 单细胞悬液。 手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。 石蜡包埋组织制备?单细胞悬液 石蜡包埋组织切片 二甲苯脱蜡 1-2天 水化 乙醇，蒸馏水 组织器官 胰蛋白酶 37℃，15-30min 冰PBS 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液 5. 脱落细胞单细胞悬液的制备 包括： 尿液脱落细胞 胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞 收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 置 4℃ 冰箱中 沉淀 取底部10-20ml PBS洗 3 次 300目尼龙滤网过滤 单细胞悬液 收集方法、沉淀时间 胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝 素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h 尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12