常见猪病检测方法技术分析.docVIP

猪病诊断技术规范 一、致病性大肠杆菌的检测 1 引用标准 参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。 2 范围 适用于猪大肠杆菌病的诊断。 3 检测方法 3.1 材料 3.1.1 营养肉汤 3.1.2 营养琼脂 3.1.3 EMB 3.1.4 TSI 3.1.5 IMViC生化鉴定管 3.1.6 小白鼠 3.2 分离培养 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 ℃培养18~24 h。 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取5~10个典型菌落再接种于TSI琼脂。 同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37 ℃培养16~18 h的菌液用于生化特性鉴定。 3.3 生化鉴定 挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(36±1) ℃培养24 h后观察结果。 3.3.1 靛基质试验： 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。 3.3.2 甲基红（MR）试验 滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。 VP试验 滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。 在15 min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。 3.3.4 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。 3.4 大肠杆菌鉴定结果 应符合表1要求。 表1 大肠杆菌鉴定结果 靛基质 MR VP 枸橼酸盐 鉴定 + + - - 典型大肠埃希氏杆菌 - + - - 非典型大肠埃希氏杆菌 + + - + 典型柠檬酸盐杆菌 - + - + 非典型柠檬酸盐杆菌 - - - + 典型产气杆菌 + - - + 非典型产气杆菌 出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。 3.4 致病性试验 取经营养肉汤培养后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重左右的小白鼠每株接种只，每只含菌量约为／）同时用小白鼠接种无菌肉汤作对照。饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。产气荚膜梭菌产气荚膜梭荚膜梭菌, 有少量形成短链和长链，如见链球菌则表明病料中可能含有链球菌。 5 病原分离鉴定 无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结内部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板，36±1℃培养24±2 h，如果菌落生长缓慢，可延长至48±2 h后观察。 如果是猪链球菌2型，培养24 h，在普通琼脂绵羊血平板形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径0.3 mm～1mm，大多数菌株呈α溶血，部分菌株产生β溶血。 将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径μl固体培养物以双球菌为多，少量呈3个～5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。 菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢试验符合者，可初步确定为链球菌。 6 生化鉴定 经初步鉴定后，做5％乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。 7 PCR鉴定是否为猪链球菌2型 必要时进行猪链球菌2型毒力因子PCR检测。 7.1 仪器：台式高速（12000 r/min）离心机；DNA扩增仪；水浴锅；稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；电泳凝胶成相分析系统；可调移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；与移液器匹配的滴头；1.5 mL离心管；0.5 mL或0.2 mL（与扩增仪配套）塑料管。 7.2 试剂 7.2.1 细菌DNA提取试剂盒 7.2.2 2.5 mmol/L dNTP 7.2.3 10×PCR Buffer 7.2.4 25 mmol/L MgCl2 7.2.5 10 pmol/L引物 7.2.6 Taq DNA聚合酶 7.2.7 50×TAE（保存液）和1×TAE（使用液） 7.2.8 琼脂糖：电泳级 7.2.9 CYBgreen 7.3 PCR引物 根据猪链球菌2型溶血素基因设计引物，引物序列如下，其目的片断长度为495 bp。 sly1：5’-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3’(1542) sly2：5’-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3’(2036) 7.4 DNA提取 利用对数生长期的液体