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IncTCF7通过调控TCF7，激活wnt通路，促进了肝癌干细胞更新与增殖 作者：王刚 来源：GCBI知识库 在最近发表于《Cell Stem Cell》的文章 The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self-Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling中，中科院物理研究所的研究人员通过lncTCF7将SWI/SNF复合物招募至TCF7启动子处调控了它的表达，导致了Wnt信号激活促进了肝癌干细胞自我更新和肿瘤增殖。 研究背景 肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，在我国每年大约有25万人死于肝癌，位居恶性肿瘤死亡率的第二位，是严重威胁人们健康乃至生命的恶性疾病。目前对肝癌的治疗主要有手术、放疗、化疗及生物治疗等，总体治疗效果不佳。近年癌症干细胞(cancer stem cells, CSCs)学说备受人们关注，许多学者认为肿瘤起源于干细胞，且肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与癌症干细胞相关。 长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、缺少特异完整开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA。研究显示，lncRNA可参与表观遗传修饰，在肝癌的发生、发展、浸润和转移中发挥重要作用。lncRNA还可以诱导肝癌化疗药物产生耐药而导致化疗失败。此外，近期有研究报道发现lncRNA能够调控干细胞的自我更新和谱系分化。探究lncRNA、癌症干细胞与肝癌之间的联系及分子机制将有助于开发出有效的肝癌治疗和复发预防策略。 论文设计实验思路 1.LncTCF7 在肝癌干细胞是高度表达的 图1 首先作者使用肿瘤干细胞标志物CD133，CD13标记，分别在三株肝癌细胞系Hun7，hep3B，PLC中分离出CD133，CD13阳性细胞和阴性细胞，通过芯片的方法找到差异lncRNA(图1左)，此处设计实验的优点：采用多种肝癌细胞系，这样筛选出来的lncRNA，作为候选的一致性更强，课题成功率更高。接下来虽然作者在数据库中可以找到lncTCF7的序列，但是作为严谨的实验论文，作者在此根据芯片的序列，通过RACE的方法将在三种细胞系中的lncTCF7序列扩增出来，此处设计实验的优点采用RACE可以避免编辑质疑你的lncTCF7在文章细胞系中是否存在全长序列(图1右)。接下来作者通过RT-PCR检验芯片的数据和实验数据是否一致，分别采用肿瘤干细胞特征细胞和能够克隆形成能力的细胞，表明实验数据和芯片数据一致(图2)。 图2 2. LncTCF7对于肝癌干细胞的维持是必须的 作者通过干扰lncTCF7的序列，检测肝癌细胞克隆形成能力和干扰lncTCF7在总细胞中所占的比例降低(图3)。在机制上表明，感染后干性基因表达量降低(图4)，并且lncTCF7过表达。由于lncTCF7含有外显子序列，作者通过体外表达实验证明lncTCF7不能生成蛋白，此处细节作者考虑非常周全(图5)。过表达lncTCF7后，肝癌细胞克隆形成能力和干扰lncTCF7在总细胞中所占的比例升高(图6)，并且分子机制也得到验证(图7)。此处的设计优点使进行了干扰和过表达的双向验证。 图3 图4 图5 图6 图7 3. LncTCF7基因通过启动TCF7的表达激活Wnt信号通路 通过RNA-SEQ分析干扰LncTCF7基因前后的表达情况，并通过RT-PCR以及WB的方法发现主要影响的是Wnt信号通路(图8)：研究进一步发现干扰LncTCF7后，TCF7的表达量明显下调，TCF7在肿瘤标本中也是表达升高的。此处找到了LncTCF7作用下游的关键转录因子，此处使整个文章可以完全贯穿。 图8 4. LncTCF7通过募集SWI/SNF 复合物调控TCF7 TCF7表达 作者首先用RNA-pull down 实验，用LncTCF7的正向序列和反向序列，然后通过电泳和质谱，找到正义链特异性结合的蛋白质，并通过质谱和WB确定LncTCF7结合的主要是BRG1，BAF170，SNF5(图9)：通过LncTCF7截短体实验，得到LncTCF7的468-683是结合这三个转录因子的区域， EMSA进一步验证LncTCF7可以和三个转录因子结合。而且干扰三个转录因子也能产生相同的表型(图10)，证明找到了关键结合的转录因子。 图9 图10 结论 本篇文章在设计思路上环环相扣，实验验证方式都是多种手段验证，是一篇不可多得的文章。最后展示全文的模式图： 本文来自GCBI学院用户的分享！ 往期课程视频请点击：/html/index.html 扫描二维码参加直播课程！ 每周四晚八点，GCBI课堂在线直播，高校教授、专家高手分享科研进展、实验思路和数据结果，这里只有干货