细胞工程_单克隆抗体解决方案.doc

单克隆抗体 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体的制备 原理：要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体????? 一．动物的选择与免疫 　1．动物的选择 ????? 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 　2．免疫方案 ????? 　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 ????? （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 ????? 　初次免疫 ：抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）。3周后，第二次免疫 ：剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）。3周后第三次免疫： 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）。2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）。3天后取脾融合。????? 　 　 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如： ①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。????? （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×10^7个细胞。初次免疫 1×10^7/0.5ml ip。2～3周后，第二次免疫 1×10^7/0.5ml ip。3周后，加强免疫（融合前三天）1×10^7/0.5ml ip或iv，取脾融合。 3. 细胞融合 细胞融合前准备 ?????（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。????? ????? 　　 骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×10^5/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象， 应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 ????? （2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×10^4。 细胞融合的步骤 ???（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠（6～10周），拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min后?，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min。用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105