2012.4.28 PCR.ppt

谢谢！ 高温变性 低温退火 中温延伸 专利配方的染料比SYBR? Green I 产生更明亮的荧光。与SYBR? Green I 相比，该染料对PCR 的抑制作用更小，使扩增更有效，在采用与SYBR? Green I 相同的波长检测条件和设置的情况下，通常能更早得到Ct 值，线性范围也更宽。系统使用GoScriptTM 逆转录系统 进行cDNA 合成，并采 GoTaq? qPCR Master Mix 进行定量PCR。GoTaq? 两步法RT-qPCR 系该统将GoScriptTM 逆转录酶的超强活性和GoTaq? qPCR Master Mix 的超亮荧光结合在一起 * 不对称PCR 就像任何DNA一样，PCR的双链DNA产物也可以供序列测定使用。 然而，按照Sanger双脱氧末端链终止法测定DNA的核苷酸序列，最好是使用单链模版DNA。 现在已经发展出了一种专门用于制备单链DNA的技术—不对称PCR技术。 这种技术，除了使用的两种引物浓度相差100倍以外，其他的方面跟常规PCR技术没有什么本质的区别。 不对称PCR的原理 PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的1%（或2%）。 经过PCR循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继续引导DNA合成。 这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。 多重PCR 一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同 应用 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 1）多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增. 2）某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等. 巢式PCR 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异 。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 　　巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。 Touchdown PCR：用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。 逆转录PCR 原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。 是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法.可以用来分析不同组织，或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性。 常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）： 酶活性最适温度42℃ MMLV（Moloney murine leukemia virus）：酶活性最适温度37℃ Promega相关产品 Promega相关产品 Promega相关产品 实时荧光定量PCR(Q-PCR) Q-PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个P