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实时荧光定量（Realtime ）PCR检测 ●?? 原理 ?? 所谓的实时荧光定量 PCR ，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线 ???? 一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念： 荧光阈值 和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（ threshold value )。 ???? 定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（ t ）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因些只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 SYBR Green Ⅰ荧光染料 ●??荧光定量 PCR 实验过程 a. 准备样品及试剂PCR Master Mix ；光学96孔板和光学盖；客户样品cDNA（浓度不低于10ng/ul ）； b. 设计并合成引物和 TaqMan 探针 c. 定量 PCR 实验 d. 引物和探针稀释 e. 制备标准曲线样品 ???? 取一个客户的样品做至少5个梯度稀释，用于做标准曲线。如果需要做绝对定量，则先要用客户样品进行扩增，把扩增片段连入质粒，通过大肠杆菌扩增质粒，抽提出质粒测定浓度，换算成目的片段的拷贝数或纳克数，在将质粒DNA 进行至少 5 个梯度稀释用于做标准曲线；如果用看家基因进行相对定量，则无需制备目的片段的克隆。 样品目的基因的荧光定量 PCR （每样品每基因都进行三孔平行实验，保证实验结果的准确性） ●??荧光定量 PCR 的应用范围 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP 检测等。目前实时荧光 PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： a.研究各种处理对细胞 mRNA 表达量变化的影响 b.比较病理组织与正常组织中各种 mRNA 表达量差异 c.DNA 或 RNA 的转染量与实验结果关系的研究 d.基因整合拷贝数的研究 e.疾病、药物及医疗方面： f.新药开发、药物疗效研究 g.个人基因型与药物疗效之间的关系 h.药物治疗前后相关基因表达量的变化 I.疾病的发病监控、建立病原体病分子诊断标准 ●??技术服务内容和价格： a.引物、探针的设计、合成和荧光标记； b.样品的处理（如 DNA 和 RNA 抽提、逆转录、标准品的制备等）； c. PCR 条件的摸索，产物的鉴定； d.提供配套的内外参照； e.定量 PCR 实验及结果数据的处理和分析。 方法 样本数 收费标准 工作日 Taqman 探针 1-10 个 2000 元 / 条探针设计合成 300 元?? / 基因样品分析费用 300 元?? /home 基因样品分析费用 15 个工作日 10-30 个 2000 元 / 条探针设计合成 250 元?? / 基因样品分析费用 250 元 / home 基因样品分析费用 20 个工作日 30 个