SOP-True Blot抗体.docVIP

True blot多抗的制备 抗体： 小鼠IgG 山羊抗小鼠IgG HRP-标记的抗山羊IgG抗体 抗原性抗体（小鼠IgG）的变性： 方案一 1. 抗原性抗体溶液加入使终浓度为0.1％SDS， 2－巯基乙醇，沸水5分钟。 2. G－25脱盐柱除去2－巯基乙醇。 3. 置透析袋，对含有 M半胱氨酸的PBS缓冲液透析，4C过夜。 4. 非还原SDS分析，检测氧化性抗体的含量。 5. 置透析袋对PBS充分透析除去半胱氨酸。 方案二 1．抗原性抗体溶液加入SMCC使终浓度与蛋白浓度比为1：5。 变性抗体与凝胶的连接： 采用-NH2方法。 山羊抗小鼠抗体经凝胶吸附： 抗小鼠抗体适量与凝胶室温下充分混合2小时。 装入P10柱，收集流穿液（目的成分）。 大量PBS淋洗凝胶后，以0.1M甘氨酸（PH 3.0）洗脱，根据紫外280nm吸收值收集洗脱的蛋白组分。 流穿液和洗脱液检测280/260nm吸收值计算蛋白浓度。 流穿液和洗脱液进行SDS分析。 （必要时重复以上实验一次） 目的抗体的印迹分析： 小鼠IgG SDS。 转膜至NC膜。 膜封闭后分别加入0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ug/ml的经特异吸附的(目的抗体)和未经吸附的山羊抗小鼠IgG抗体。 洗膜后加入HRP－标记的抗山羊IgG抗体。 DAB显色。 比较同一浓度下两种抗体（经吸附和未经吸附）显色带的差异，确定未经吸附抗体显色而经吸附抗体未显色的浓度范围。 True blot单抗的制备 动物：Balb/c小鼠、Lewis大鼠 免疫剂量：200μg/次。 免疫容积：0.5ml/鼠/次。 免疫部位：背部皮下，多部位/次，末次采用腹腔或静脉注射（相同剂量免疫原但不含助剂）。 免疫方案： d0 第一次免疫注射，采用CFA。 d21 第二次免疫注射,采用IFA。 d35 尾静脉或眼眶静脉采血0.3－0.5ml，提取血清进行ELISA检测和/或Western blot。 d42 第三次免疫，采用IFA。 d63 第四次免疫，不采用助剂，腹腔或静脉注射相同剂量免疫原。 d66 眼眶采血处死，取脾进行细胞融合。提取血清备用。 间接ELISA法检测抗血清效价 1) 用PH9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释抗原IgG和变性IgG（制备如前）至10ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，置入4℃冰箱过夜。 2) 用PH7.2－7.4的PBS（含0.05％吐温20）洗涤5次，拍干,加入5％的脱脂奶粉溶液（PBST配制）每孔200ul。放入37℃烘箱2小时。 3) 拍干。加入梯度稀释的血清样品（1000－12800倍）和1000倍小鼠的对照血清样品每孔100ul，放入37℃烘箱1小时。 4) 用PH7.2－7.4的PBS（含0.05％吐温20）洗涤5次，拍干。 5) 加入酶标记抗体（经human，rabbit，goat，mouse/rat IgG吸附）每孔100ul，放入 37℃烘箱1小时。 6) 用PH7.2－7.4的PBS（含0.05％吐温20）洗涤5次，拍干。 7) 加入底物TMB显色，每孔100ul。室温放置5min。 8) 加入2mol/L的硫酸每孔50ul终止。 9) 酶标仪450nm/630nm双波长读数。 10) A450样品/A450对照≥2判为阳性，确定IgG和变性IgG各自的效价。 骨髓瘤细胞的准备 1) 细胞的复苏：将冻存在液氮中的细胞管取出，放入37℃水浴中，使迅速融化 将细胞转移入10ml离心管内，加入10mlDMEM含15％胎牛血清，离心1000rpm/分 10分钟, 弃上清，加入5ml的DMEM含15％胎牛血清，转移入75cm的培养瓶中培养 2) 在细胞融合前一周，复苏骨髓瘤细胞sp2/0，并扩增传代，保持良好的细胞活力，用0.5%苔肦蓝染色，用显微镜计数，透亮不着色的活细胞应在90％以上。 饲养细胞的制备 1) 取BALB/C小鼠3－5只，用颈椎脱位处死后，浸泡在75％酒精或1：1000新洁而灭溶液中5分钟。 2) 取出小鼠固定在蜡板上，使腹部朝上，用无菌剪刀在小鼠腹部皮肤剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外溢。进而剥离腹部皮肤，暴露腹膜，用灭菌注射器将DMEM培养液5ml注入腹腔中，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，另一手轻轻按摩腹腔约1－2分钟。 3) 用原注射器抽取腹腔内液体，每只约可得4－4.5ml，注入50ml离心管中。用含1％HAT 15％胎牛血清的DMEM补满至100ml（2管）。摇匀，放入96孔细胞板中 ，每孔100ul 37℃， 5％CO2培养箱中培养。 免疫大/小鼠脾脏的制备 1) 免疫小鼠眼眶放血，脱颈处死，放入75％的酒精中消毒