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以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略 点击：112 添加时间： 2007-7-27 9:29:25 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。 dqiE:=J ?一、 包含体的洗涤： 8/0=8u{‘Y ?纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白，包含体的洗涤至关重要，实验室最常用的破碎细胞的方法是超声破碎，超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，需在冰水浴中间断进行，一般选择超声强度和次数与包含体表达状况有关，表达量高，包含体致密的可以反复多次超声，和多次用超声缓冲液吹洗，8000－10000 rpm/min 10min 弃上清，留取沉淀；对于表达量低，包含体不够致密的，在洗涤时就应注意，超声条件要温和，离心速度要提高12000－15000rpm/min 10－15min，必要时可以加入1－5％的TritonX－100和1－4M尿素浸泡过夜，或进行磁力搅拌以增加洗涤强度和净度。 f|/8`x ?二、 包含体的变性 QsuKtro5N ?常用的变性剂有8M尿素、6M盐酸胍、SDS。尿素因价格低廉、呈电中性，变性条件温和，稀释复性后可以直接过离子交换剂进行纯化，常作为包含体变性剂的首选。盐酸胍是强变性剂，复性时易出现沉淀，影响回收，且复性液中必须透析除净盐酸胍后，方可进行离子交换层析分离，不作首选；SDS与蛋白形成带负电的阴离子复合物，并与阴离子交换剂有强吸附，与阳离子交换剂不结合，更致命的弱点是常常会影响蛋白质的生物学活性，不常使用。 {|YAgv8 ?变性条件的选择，包含体变性完全与否直接影响进一步的复性，因此包含体的变性一定要完全。对于易变性的包含体，室温放置或37℃1－3hr，甚至过夜变性，不易变性的包含体，可选择60℃3hr变性。对于含有二硫键的蛋白质，为了变性完全，使二硫键完全打开，还应加入还原剂?－ME和DTT。 }J#h;]tF ?三、 蛋白质的复性 q3LdjQ ?蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。减少中间体的形成，可选用添加小分子物质，又叫分子伴侣，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物质帮助蛋白质正确折叠。避免多聚体的形成可以加入氧化还原剂（DTT、?－ME、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），帮助蛋白质复性中二硫键的正确配对，减少错配率。 VH(~6cQz ?复性缓冲液的pH要远离等电点，离子强度不易过高，10－50mmol/L，离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不利于离子交换层析的分离；复性液温度不易过高在4℃－10℃较合适对于耐热蛋白也可以室温复性。复性时间，以天然表达的重组蛋白复性应在6hr以上，需要进行酶切的融和表达重组蛋白，至少要复性1hr以上，方可进行进一步的酶切。 ]m)@).S ?复性方式：常用的有透析复性和稀释复性。透析复性适用于小样品制备；对于大样品制备，采用稀释复性法简便、实用。一般包含体蛋白的复性浓度不易过大，不同的蛋白质有所区别，一般掌握在100－200ug/ml较合适，蛋白浓度太稀使纯化流程过长，蛋白浓度太浓，蛋白质复性不完全，会直接影响蛋白的回收率。直接稀释有困难的，也可以试用分段稀释法。 =SxPS @ ?蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，这个最佳条件的选择是靠大量的实验来完成的。只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。 )%t59p ?g_ z
^2 ?四、 层析条件的选择 1~HX - pI~ ?蛋白质的层析纯化步骤无硬性规定，一般以最简单的技术、最少的步骤、最高的回收率、最低的成本、最快的速度纯化出合格的蛋白纯品为最佳方案。 ~N;*Hk^~‘ ?离子交换层析因其交换量大，流速快，可以快速吸附目的蛋白，去除大部分杂蛋白，因此常作为初级纯化的首选。对于硫酸铵沉淀的样品的纯化，应该首选疏水层析。进一步的精纯化可以变换条件进一步分离，或是选用凝胶过滤层析方法，以获得纯蛋白。