Folin法测定碱性蛋白酶活性.pptVIP

实验一 Folin法测定碱性蛋白酶活性 Folin法测定碱性蛋白酶活性 一、实验目的 了解蛋白酶活测定方法及原理，掌握其基本操作。 二、实验原理 （1）碱性蛋白酶：能催化蛋白质水解，它不仅能水解肽键，也能水解酰胺键和脂键等，因此可以利用酪蛋白为底物进行水解反应。 （2）Folin试剂：磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下不稳定，可被酚类化合物还原，而呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）由于蛋白质或者水解产物中含有具酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），故也可呈上述反应。 本实验就是利用碱性蛋白酶水解产物中含有酚基的氨基酸的呈色反应强度来表示蛋白酶活性。 二、实验原理 （3）在一定pH和温度（40 ℃ ）下，蛋白酶液和底物酪蛋白反应，经过一段时间后，加入三氯乙酸终止酶反应，并使多余的酪蛋白发生沉淀而与水解产物分开。 过滤后，取滤液（含蛋白水解液和三氯乙酸）用碳酸钠碱化，再加入folin试剂使之显色，蓝色强度与蛋白水解产物的量成正比，在一定浓度范围内符合比尔定律，因此可以推断出蛋白酶的活性。 （4）碱性蛋白酶酶活定义为：上述实验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个酶活单位。 三、实验器材与试剂 1、实验器材 精密电子天平、分光光度计、恒温水浴锅、容量瓶、刻度吸管（或可调式移液器）、烧杯、量筒、滤纸 2、 实验试剂 folin试剂、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸、 四、实验操作—1、标准曲线测定 四、实验操作-- 2、酶活测定 （1）、水解反应： 先用一支试管取6毫升酪蛋白试剂放入40℃恒温水浴中预热5min。 然后取2支干净试管，在试管中先加入1.0ml碱性蛋白酶稀释酶液，置于40℃恒温水浴中预热3min，再加入同样预热过的2%酪蛋白1.0ml，立即计时，精确反应10min。 加入三氯乙酸2.0ml终止反应，混匀，置于40℃恒温水浴中沉淀15min。 用加入滤纸的漏斗过滤，收集滤液。 （2）、测定酶活： 各取1.0ml滤液到另一试管中，加入0.4mol/L Na2CO3 5.0ml，再加入Folin试剂1.0ml，混匀，置于40℃恒温水浴中20min，冷却后于680nm波长处比色。 具体见下表： 四、实验操作-- 2、酶活测定 四、实验操作-- 3、计算 1、以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸量（ μg ）为横坐标作标准曲线图，线性回归，求直线方程和R2，并求斜率的倒数K。 2、碱性蛋白酶活力计算 酶活力(μg/ml) = K·A·N·4/10 K-标准曲线斜率的倒数 A-吸光度值 N - 酶的稀释倍数10000倍 4-反应总体积为4mL 10 - 反应时间为10min 将两个样品测定结果取平均值后代入公式，计算酶活 五、实验注意事项 1）试管要做好标记，可用记号笔（或标签纸） 2）酶活测定过程中，一定要先将酶液和酪蛋白分别进行预热预热，然后才能分别取1毫升加入同一试管开始计时。 3）吸取酶液和酪蛋白一定要精确。 4）精确计时，水解反应中的时间对酶活力的计算影响很大，缩短平行的两个试管加酪蛋白的时间差。 5）比色测定时，一定要放入相应的空管对照。 6）做标准曲线时，一定要以测定液中实际所含的酪氨酸为横坐标，用所取酪氨酸标准液体积*100μg/mL。 * * 混匀，水浴40℃ 20min，冷却后680nm波长处比色 1.0 Folin试剂（ml） 5.0 Na2CO3（ml） 1.0 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.2mol/L HCl（ml） 0.0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.1 标准酪氨酸（ml） 7（对照） 6 5 4 3 2 1 管号 取试管干净7支，分别吸取标准酪氨酸0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6于试管中，并用0.2mol/L HCl溶液稀释至1.0ml，分别加入0.4mol/L Na2CO35.0ml，再加入Folin试剂1.0ml，混匀，置于40℃恒温水浴中20min，冷却后于680nm波长处比色。 混匀，水浴40℃ 20min，冷却后680nm波长处比色 　1.0 Folin试剂（ml） 5.0 Na2CO3（ml） 沉淀，40℃ 15min,过滤，收集滤液，分别吸取1.0ml滤液到10、11号管，然后再加入以下两种试剂 　 　 2.0 三氯乙酸（ml） 　 　 精确计时，40℃ 10min 先加入2.0ml三氯乙酸，再加入1.0ml酪蛋白，无需加热 　 　 1.0 1.0 2%酪蛋白（ml） 1.0 　 　 1.0 1.0 碱性蛋白酶液（ml） 　 　 　 预热酶液和酪蛋白，40℃ 3min 9号（空白） 8 7 管号 空白对照