CRISPRcas9介绍.docVIP

基因组改造新技术CRISPR–Cas系统 有一种细菌编码的酶能够利用向导RNA（guide RNA）分子对特定的DNA片段进行定向切割，科学家们利用这种特点开发出了一种能够对基因组进行特异性定点改造的工具，对细胞乃至整个生物体进行基因组改造。目前已经利用这种技术对细菌、人体细胞以及斑马鱼进行过成功的遗传学改造工作。 日本大阪大学（Osaka University）的科研人员们曾经在1987年发表过一篇论文，不过这篇论文在当时并没有引起太多人的注意，只不过是一篇普普通通的小文章。这帮大阪大学的科学家当时正在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究，不过他们在工作中发现，在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。关于这样一个重复序列他们当时在论文中是这样评价的——“我们目前也不太清楚这些序列的生物学意义。”不过这个在差不多三十年之前取得的不起眼的“小发现”在今天却绽放出了耀眼的光芒，因为如今科学家们正是利用这个小片段找到了一种可以对多种生物的基因组进行遗传改造的工具，而且这种方法操作起来还非常地简单。就在短短的一个月之内，在包括《科学》（Science）和《自然 生物技术》（Nature Biotechnology）等杂志上就已经发表了5篇相关的论文介绍这个现在被称作CRISPR–Cas系统（CRISPR–Cas systems）、简便而又实用的基因组改造新技术。 近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。后续的遗传学试验和生物化学试验也证实了这种猜测。 虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶（endonuclease）——Cas9就足够了，我们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统（type II systems），如图1所示。Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序（proto-spacer adjacent motifs，PAM基序）。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是CRISPR RNA crRNA 和反式作用CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA 。不过最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称，在多种类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制（homologous recombination, HR）和非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining, NHEJ），不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。 图1 RNA介导的Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图。Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达这种蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或者质粒等外源DNA的侵入。Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，这是因为这些向导RNA分子含有与靶DNA序列互补的序列，我们称之为PAM序列。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制（homologous recombination）或者非同源末端连接机制（non-homologous end joining）对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DN