伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的测定.docVIP

伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的测定 摘要：使用凝胶过滤层析法和考马斯亮蓝法及SDS电泳技术对伞状植物叶片中可溶性蛋白质的含量及相对分子质量进行测定，凝胶过滤表明：随吸光值的不同，蛋白质的含量也不同。 SDS - PAGE电泳表明：伞状植物叶片中存在大量相对分子质量为20-110KD的蛋白质。 关键词：伞状植物叶片；蛋白质；分离纯化；分子量；凝胶过滤；吸光值；SDS电泳。 引言：伞形科(Apiaceae，Umbelliferae)一年生至多年生草本茎中空或有髓。叶互生，叶片分裂或多裂，一回掌状分裂或一回至四回羽状分裂或一回至二回三出式羽状分裂的复叶；叶柄基部膨大，或呈鞘状。花序常为复伞形花序，有时为单伞形花序；花常两性，整齐；花萼和子房结合，裂齿5 或不明显；花瓣5；雄蕊和花瓣同数，互生；子房下位，2室，每室有1胚珠；花柱2，基部往往膨大成花柱基(stylopodium)，即上位花盘。果实由 2个有棱或有翅的心皮构成，双悬果，每个分果有5条主棱(2条侧棱，2条中棱，1条背棱)，分果背腹压扁或两侧压扁；种子胚乳丰富；胚小。染色体：X＝4 -12。本科约800属，3000种，分布于北温带、亚热带或热带的高山上，其中有些种类供药用、食用和观赏用。我国约有90属，500多种，全国均有分布。(gel filtration)是分离纯化蛋白质的有效方法之一，有称凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)，分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等SDS电泳法（十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质分子量SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。- 20 ℃）。然后一起在转速为1000的冷冻离心机中离心10min，取上清液加预冷丙酮放置20℃的环境中0.5h，再以同样的转速离心10min，保存一份，在取沉淀加4ml的缓冲液溶解，在5000r/min的离心机中离心10min，取上清液保存备用。 1. 2. 2蛋白质的分离纯化 用凝胶过滤层析法 [1]分离纯化蛋白质。使用Sephdex G-75(分级分离的分子量范围3 000—80 000)的凝胶装柱（层析柱25×30cm），使胶面平正，用洗脱液平衡，测得流速为2min/管，上样，加超声后的蛋白提取液2mm（柱床体积的1-5%），洗脱流速为4min/ 管，每1.5ml为一管收集分离纯化液共22管。然后用考马斯亮蓝染色法[2 ]测蛋白质的吸光值如图1。 1.2.3 蛋白质相对分子量的测定　 采用SDS - PAGE电泳 [2 ]进行蛋白质组分分析，分离胶与浓缩胶的配置如表1。 取原液和沉淀溶解液及部分分离纯化后的蛋白样液共7组各取50μl分别加50μl还原缓冲液，混合后沸水浴加热3-5min待用。上样量为30μl，电泳是所加Marker为10μl。 电泳结束后加入染色液染色24 h,之后脱色至蛋白色带清晰为止. 最后在凝胶成像仪中拍照,利用蛋白质单向电泳软件进行相对分子量统计分析. 结果与分析 2.1 蛋白质分离纯化的结果 由蛋白质的吸光值的曲线可知,蛋白质在280nm下，有大量的吸收，图1中有三个峰值，最大吸光度的峰值为0.526，凝胶过滤时大分子量的蛋白质不能进如凝胶内部，而随洗脱液一起先流出，小分子蛋白进入凝胶内部的多空网状结构而后流出。 2.2 蛋白质组分分析 根据SDS电泳图谱中蛋白质条带可辨颜色的深浅不同（图2）,分离纯化后的杂蛋白减少。不同样液中蛋白质的分子量不同（图3），在原液未超声中包括的蛋白质：94.17 54.46 40.33 15.54KD蛋白，原样超声中包括的蛋白：89.31 51.65 38.25 21.74 15.00 KD蛋白，未超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.90 49.86 36.93 21.74 14.23 12.13KD蛋白，超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.90 49.86 36.93 23.74 14.48KD蛋白。凝胶过滤中吸光值最大的中包括的蛋白质：114.36 87.74 72.25 62.73 51.65 42.53 15.54KD蛋白。由表2可看出，蛋白质分子量依次减小，相应的迁移率依次增大，即迁移率与分子量成反比。结合图2与表1在280nm下，分子量大的蛋白含量较多。 讨论 凝胶过滤层析可以分离纯化蛋白质，使分子量不同的蛋白分开，分子的先流出，小的后流出，凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它设备简单、