生物化学-(原创)蛋白质相互作用的研究方法重点分析.doc

蛋白质相互作用的研究方法 摘要 过去15年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文综述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括酵母双杂交技术，GST pull-down技术，免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等多种研究方法，总结了各种研究方法的原理及应用。 关键词：蛋白质，相互作用，研究方法 1 酵母双杂交技术(two hybrid system) 1.1基本原理 真核生物细胞转录激活因子一般都含有2个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-bindingdomain, BD)和DNA转录激活结构域(transcription activation domain, AD)。这两个结构域相互独立但功能上又相互依赖,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的活性。将拟研究的编码“猎物”蛋白的基因与AD序列结合,编码“诱饵”蛋白的基因与BD序列结合,形成两段融合基因,并在同一菌株核内表达,若“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白在核内存在相互作用,就可以重新形成完整的有活性的转录因子,从而激活报告基因的转录。因此根据报告基因的表达与否,即可判断“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间是否具有相互作用。 1.2应用 Hurst等利用酵母双杂交的方法研究与乳腺癌转移抑制因子1（BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白为Hsp90伴侣蛋白。Reddi等利用酵母双杂交系统研究肝炎B病毒反式作用因子HBx蛋白的自我偶联作用，结果发现HBx蛋白在分子环境中可以通过其碳末端区域产生自我偶联作用。酵母双杂交技术也应用于大规模蛋白质相互作用网络的研究，Lim等人利用此技术鉴定了770多个可能相互作用的蛋白，有75对蛋白质产生相互作用，其中有83%相互作用的蛋白质在哺乳动物细胞中得到验证。 1.3优点 在检测蛋白质之间相互作用方面，酵母双杂交系统具有非常高的灵敏度，尤其对蛋白质间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测到。酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用是基于酵母细胞内的试验，不需要经过提纯蛋白来研究蛋白的相互作用，避免了提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物活性的蛋白-蛋白相互作用，反映体内的真实的相互作用情况。 1.4缺点 （1）对相互作用蛋白在细胞内的定位要求严格，酵母双杂交不能检测定位于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白而且融合表达可能会影响目的蛋白修饰和折叠，尤其在研究异源蛋白相互作用时，蛋白不一定能正确修饰和折叠，从而影响蛋白的活性。 （2）由于某些蛋白质本身具有转录激活功，使猎物蛋白AD融合基因与“诱饵”蛋白BD融合基因表达产物无需特异结合就能启动转录系统，从而产生假阳性结果。 （3）DBD-X和AD-Y不是通过DBD-X-Y-AD直接激活转录，而是通过第3种蛋白或多蛋白的复合体把X、Y募集到一起，激活转录，从而产生假阳性结果。 解决方法：Kim等设计了一种新的酵母遗传筛选方法———一加二杂交系统（one plus two hybrid system），这个系统可以高效率地筛选特异干扰已知相互作用蛋白的无义突变，这种系统允许在同一细胞中存在双重报告系统。分裂-泛素膜酵母双杂交系统。主要是用于检测膜蛋白的相互作用。Vidalain等为了解决高通量酵母双杂交技术的假阳性问题，主要是通过阳性酵母细胞的扩大培养消除污染猎物质粒的影响。 2 免疫共沉淀技术(coimmunoprecipitation) 2.1基本原理 细胞裂解物中加入抗体,与抗原形成特异免疫复合物,经过洗脱,收集免疫复合物,然后进行SDS及Western blotting分析.如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。 2.2应用 用于确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质；用于验证两个已知相互作用的蛋白质。 Operana等利用免疫共沉淀技术验证UGT1A蛋白质之间的相互作用，证实了每个UGT1A蛋白都可以潜在的形成同型二聚体。免疫共沉淀技术结果还表明UGT1A可以与所有的UGT1A蛋白形成异型二聚体，确证了在活细胞中利用荧光共振能量转移（FRET）技术得到的结果。Walker等利用免疫共沉淀技术发现死亡蛋白和p53蛋白形成的复合物存在于白血病的血细胞的细胞质中而不存在于正常血细胞中。 2.3优点:(1)与蛋白亲和层析一样,检测的产物是粗提物; (2)抗原与相互作用蛋白以细胞中相类似的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应;