生化实验1重点分析.doc

生物化学实验报告 姓 名： 许梨梨 学 号： 3120100024 专业年级： 2013级医学影像学 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 201410-24 实验地点 合作者 许琮 指导老师 何肖娟评分 教师签名 批改日期 实验目的 2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二实验原理 薄层层析法 -解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来。 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 本实验采用硅胶吸附薄层层析。硅胶吸附薄层层析的特点：1.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。2.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。3.硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。 （二）氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基酸，与此同时。还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 （三）相对迁移率—Rf值的计算 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法 （一）实验材料 1.分析样品：（1）混合氨基酸溶液 （2）氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。 2．试剂：（1）吸附剂：硅胶； （2）黏合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠； （3）展层-显色剂：为正丁醇、乙醇、茚三酮、丙酮、蒸馏水混合液； 3.仪器及器材：（1）层析板（5*15cm）；（2）小烧杯及药匙；（3）量筒（10ml）； （4）小尺子和铅笔；（5）毛细玻璃管；（6）层析缸；（7）烘箱；（8）天平 （二）实验方法 1.实验流程： 2.操作步骤 ： 四、结果与讨论 （一）结果 （1）层析时，能清楚地看到展层-显色剂在层析板上运动的痕迹。通过计时及观察展层剂前沿的位置，可以大致看出展层剂前沿的移动速率随前沿所处高度的增加而减缓。当前缘到达层析板中间部位时，能观察到展层剂前沿移动的速率变得非常缓慢。 （2）层析过程中层析板上没有显色现象。打开层析缸能闻见浓烈的丙酮味。 （3）在烘箱内烘烤10分钟左右时，即可见层析板上开始显现紫红色的斑点，并且斑点颜色在一定时间范围内随时间的增加而加深。丙氨酸的斑点最高，颜色深浅介于甘氨酸和精氨酸之间；甘氨酸斑点位置次之，颜色最浅；精氨酸斑点最低，颜色最深；混合氨基酸处有3个界限较分明的斑点，分别标记为混合点1、2、3。混合点1和丙氨酸位置大致等高，混合点2和甘氨酸的位置大致等高，混合点3和精氨酸的位置大致等高。结果如图1所示。 (4)制板时，在自然晾干情况下，原本糊状的固定相逐渐变成固体。 图 1氨基酸薄层层析结果 2.实验数据 表 1 各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及溶剂前缘至样品中心距离记录 单位：cm 2 3 平均a值 2.60 2.59 4.95 2.01 2.05 2.02 2.03 4.95 1.31 1.30 1.29 1.30 4.95 2.49 2.41 2.42 2.44 4.95 2.00 1.99 2.00 2.00 4.95 1.29 1.29 1.30 1.29 4.95 3.结果计算与分析 计算各斑点的Rf值，结果记录见表2。 表 2氨基酸薄层层析的结果记录表 各斑点 Rf值 氨基酸名称 丙氨酸 甘氨酸 精氨酸 混合点1 混合点2 混合点3 0.523 0.410 0.263 0.493 0.404 0.261 - - - 丙氨酸 甘氨酸 精氨酸 层析板上显现出紫红色的较清晰的斑点，并且混合氨基酸处分离出3个界限较分明的斑点。 观察各斑点的位置，可见混合点1和的丙氨酸位置大致等高，混合点2和甘氨酸的位置大致等高，混合点3和精氨酸的位置大致等高。可知混合氨基酸被成功分离，并可初步判断混合点1、2、3依次为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。 通过比较表2的数据，可以进一步确定混合点1、2、3分别为丙氨酸、甘氨酸、精氨酸。 综上所述，本次实验得出混合氨基酸溶液中含有丙氨酸甘氨酸精氨酸实验成功。（二）讨论 复习思