鹿源牛病毒性腹泻病毒JZ054株的分型鉴定-讲义.doc

畜牧与兽医年第卷第期 鹿源牛病毒性腹泻病毒?株的分型鉴定 李海涛,苗利光,刘艳环,朱言柱,安亚雄,王坤 中国农业科学院特产研究所,吉林长春 摘要:为研究牛病毒性腹泻病毒?毒株生物型、基因型及遗传背景,本研究将其在细胞上进行传代培养并观察细胞培养 特性,利用荧光抗体染色和?的方法对其进行基因型鉴定研究。试验结果证明,/?毒株为生物型、基因型。 关键词:牛病毒性腹泻病毒;生物型;基因型 中图分类号:. 文献标志码: 文章编号:?.方法 牛病毒性腹泻病毒 , .. 荧光抗体鉴定 为黄病毒科瘟病毒属的代表种。是牛 / 将/?病毒液接种单层细胞 病毒性腹泻/黏膜病 ,/的病原体¨。可感染牛、 孔板,加入%标准胎牛血清的细胞培养维持 液,培养~ 。按照直接荧光抗体 羊、猪和鹿,临床表现为发热、黏膜溃疡、持续性感 检测使用说明书操作,荧光显微镜下观察 染、腹泻和生殖障碍等。 本研究将已分离到的鹿源/?株,利 结果。设立细胞阴性对照。 ..生物型鉴定 用在细胞上进行传代培养并观察细胞培养特 性、荧光抗体染色和?的方法对其进行了生 将保存在一℃的/?病毒培养液室 物型和基因型分型鉴定研究,为了解/? 温融化,接种于单层细胞, 、%:吸 株的基因遗传背景、全基因组测序、疫苗毒株驯化研 附 后弃去液体,加人%标准胎牛血清的 究奠定基础。 细胞培养维持液,℃、%:培养,并观察细胞 的生长情况。 材料与方法 .. ?基因分型鉴定 .材料 病毒接种培养 时弃去上清液,每 贴壁 ..病毒与细胞 细胞加 ,按照公司试剂 /?株由中国农业科学院特产研究所 使用说明书提取总。 ? 苗利光博士等分离保存;一型标准株 . 使用说明 按照 株、一型标准株’毒株由中 书流程,用随机引物合成/?病毒毒株 国农业科学院特产研究所苗利光博士制备保存;病毒 。合成反应恤体系: 提取的总 培养用细胞购自中国兽医药品监察所菌种保 ,斗 /斗随机弓物,斗 藏中心。 处理水,℃ , /,仙 ..试剂 冰浴 ;灿 , / 细胞培养基购自 ;标准胎 ,“. /,斗 /斗 牛血清购白天津灏洋生物制品科技有限公司; , ,斗 /, ? 购自. 、删? ℃合成 ,℃灭活 。 ;其他常规试剂均为进口或国产分析纯。 根据基因组’一区差异,分别设计 分型鉴定引物对表。以一型 株、一型标准株’毒 标准株 收稿日期:??;修回日期:?? 株作对照,作空白对照旧。反应条 基金项目:吉林省科技发展计划件:℃ ;℃ ,℃ , , 作者简介:李海涛一,男,硕士研究生,助理研究员 个循环;℃ 表。产物在.% 通信作者:苗利光,副研究员,研究方向是动物病原生物学和 琼脂糖凝胶上电泳检查结果。 分子免疫学,?:. 万方数据. . 表 分型鉴定引物 表 反应体系 细胞,并在细胞质内合成特异性抗原。 组分 体积/“ . 却 /“ . Ⅱ含 . 上游引物 。 下游引物 ./ . 无菌水 .感染/? 细胞;.细胞 结果 图 直接荧光抗体鉴定 .荧光抗体鉴定 .生物型鉴定 用直接荧光抗体检测接种/? 细胞接种/?后,? 内具 毒株的细胞,并以细胞作对照。结果 有明显的细胞病变现象,结果见图。结果显示 显示接种/?病毒液的细胞在细胞 /?是株典型的生物型毒株。如图 质有强烈的荧光信号,而正常细胞没有荧光 所示:第天时形成空泡、细胞发生融合 , 信号产生图。说明/一毒株侵染了 。 第天大部分细胞凋亡并脱落 隧≥一 出。三叁遂薹澄霎豳 图 /?毒株在细胞生长导致细胞病变 . ?基因型鉴定 录做阴性对照。 提取/?病毒的,并用随机引物 特异性引物扩增种,结果均出现 了 反转录合成。以为模板,进行分型 左右的特异性条带;一特异性引物 ’ 扩增/?结果出现了 鉴定。一 毒株和 左右的特异性 条带,一特异性引物扩增/?结果 毒株做阳性参照,以细胞总反转 万方数据畜牧与兽医年第卷第期 出现型特异 ’毒株出现相同的特异性条带,结果表明 为阴性;一 /?为一基因型毒株。 性条带;一 ’毒株出现特 异性条带,结果见图。/和 , 咖 咖瑚湖 瑚四 ./?毒株;.? 株;.一 ’毒株;.总对照;.特异性引物~?;.一特异性引物~扩增;.?特异性引物~扩增;. 图 /? ?分型鉴定 变异的现象旧。国外疫苗主要以一弱毒 讨论 苗和灭活苗为主,但严重的临床症状和急性感染多由 一引起,虽然种基因型病毒之间存在交叉保 根据接种上皮细胞培养物后是否引起细胞病变, 护,但是一疫苗不足以保护一所引起 可将分为种生物型:致细胞病变型. 的急性感染一。 ,和非致细胞病变型 本试验通过细胞增殖一/?分 , 。可在接种细胞后 ? 离株病毒,观察细胞生长状况后发现其能够在 内造成细胞病变,形成空泡、核固缩、细 细胞上较