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牛乳中具纤溶活性碱性蛋白酶的研究 白英，陈振涛 摘 要：通过ε-氨基己酸的解离作用，利用CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析、Lysine-Sepharose（赖氨酸-琼脂糖凝胶）亲和层析的方法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定，从末乳中分离出一种具有纤溶活性的碱性蛋白酶。采用凝胶色谱和等电聚焦法对其分子量和等电点进行测定。结果表明：该蛋白酶为单体蛋白，纯化倍数2.11，分子量为47.0 ku，等电点7.8。纯化后酶的活性可完全被PMSF抑制剂抑制，属于丝氨酸蛋白酶家族。对酪蛋白具有一定的水解能力。 关键词：末乳；碱性蛋白酶；纤溶活性 0引 言 近年国内外对乳中内源性和外源性蛋白酶的研究十分关注。 原料乳中蛋白酶活性在实际生产中具有重要影响。是UHT灭菌乳的贮藏和干酪成熟过程中的不稳定因素，并且产生的一些苦味物质会改变乳制品的感官特性。 碱性蛋白酶为内院蛋白酶系统中的主要成分。 国内外研究显示，对乳制品影响最大的为纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶(Plasmin, PL)是乳中固有的蛋白酶，属于碱性丝氨酸蛋白酶，在乳中与酪蛋白微粒相结合存在。在末乳期乳中含量较高。由于PL对酪蛋白的水解，破坏了乳蛋白的整体结构，使干酪组织状态变软，持水性差，而且有时由于水解不当，使干酪易带有苦味等不良风味，所以极大的影响着干酪的产量及品质。 1实 验 1.1主要试剂 V7127，三羟甲基氨基甲烷 （Tris），6—氨基己酸 ，CM Sepharose Fast Flow，Lysine-Sepharose4B，抑制剂，Marker，F—Red高灵敏度蛋白质电泳快速染液。 1.2仪器 CF-15R离心机，DU800分光光度计， 真空冷冻干燥机，Fine-dox3 全自动凝胶呈相系统， 低温层析柜，HD-4电脑核酸蛋白（紫外）检测仪，DYY-6C型电泳仪。 1.3方法 1.3.1样品处理及粗酶制备 将收集的牛末乳以2 000 g离心力，5 ℃下离心15 min脱脂。 脱脂乳中加入浓度为50 mmol/L的ε-氨基己酸（EACA），室温下静置2 h。 参照Politis的方法，用1.4 nHCl将脱脂乳调至pH值为4.4~4.7，室温下静置10~15 min。 在水浴中加热到45 ℃。 将处理后脱脂乳在离心力9 391 g，4 ℃条件下离心15 min，将乳清进行冷冻干燥备用。 1.3.2纤维蛋白平板检测 采用改进的标准纤维蛋白平板法。 取直径为9 cm 的医用无菌培养皿 ， 置于水平操作台上 ， 将1.5 mL质量浓度为7.5 g/L纤维蛋白原溶液、100 μL凝血酶溶液(42 U/mL)和8.3 mL质量分数为0.1 %的琼脂糖溶液(加热使完全溶解，并冷却至约40 ℃)混合均匀，倒平板，室温下放置2 h。 浓度为50 mmol/L磷酸缓冲液( pH 值7.4)作为空白对照，将粗提酶和缓冲液分别置于灭菌牛津杯中，37 ℃温育18 h。 1.3.3 CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析 将已经溶胀2 d的CM Sepharose Fast Flow装入层析柱(2.5 cm×80 cm)中，用50 mmol/L磷酸缓冲液( pH值为7.4)充分平衡，5%粗酶样品上样量5 mL，分别用含0.1，0.3，0.5，0.7 mol的NaCl浓度为50 mmol/L磷酸缓冲液( pH值为7.4)洗脱,流速为0.2 mL/min，收集含有酶活性的组分。 1.3.4 Lysine-Sepharose（赖氨酸-琼脂糖凝胶） 亲和层析参照Humbert 和 Berbar 等的方法，装好Lysine-Sepharose4B亲和层析柱（1×10 cm），将50 mg冷干物溶于2 mL浓度为0.3 mmol/L（pH值为7.4）的磷酸缓冲溶液中， 将样液加入Lysine-Sepharose亲和层析柱，5 ℃下静止一段时间。 用同样缓冲液洗至基线。 以15 mL/h流速， 用含浓度为0.2 mol/L ε-氨基己酸（EACA）, 0.15 mol/L氯化钠的0.3 mol/L，pH值为7.4的磷酸钾缓冲溶液洗脱，收集活力峰。 1.3.5酶活性测定 以V 7127（H-D-valyl-Lleucyl-L-lyslylp-nitroa-dide ）作为底物，采用Korycka-Dahl等改良Rollema的方法对酶的活性进行检测。50 L待测样品与950 L浓度为50 mmol/L的Tris buffer (pH值为7.4)（含110 mmol/L的NaC1,0.6 mmol/L的V7127, 2.5 mmol/L的ε-aminocaproic acid）。 于37 ℃反应1 min，在波长405 nm处连续检测每分钟吸光值的变化。 不加样品的