生化作业答案讲义.docxVIP

一、两种蛋白质相互作用研究方法的原理与基本操作流程。 （1）酵母双杂交系统 原理：当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。 基本操作流程： a、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。b、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。c、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。d、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能 与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 （2）噬茵体展示技术 原理：将待筛选的蛋白基因插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因8或基因3之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，而不影响噬菌体的完整性。每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。利用目的蛋白与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。 基本操作流程： a、构建噬菌体库 b、进行亲和筛选 c、分析所筛选克隆亲和性 （3）免疫共沉淀技术 原理： 基本操作流程： A、收获细胞，冷PBS洗涤两次，细胞裂解液冰浴裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min； B、取上清液加入适量抗体，4°C缓慢摇晃孵育过夜； C、取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； d、加入琼脂糖凝胶悬液，4°C缓慢摇晃孵育2-4h； e、细胞裂解液洗涤琼脂糖凝胶混合液，离心弃去上清液；沉淀加2x蛋白Loading Buffer煮沸5-10min，离心，上清液跑SDS胶； f、考马氏亮蓝染色、银染，Western blotting或质谱仪分析。 （4）GST 融合蛋白pull-down技术 原理： 基本流程： （5）融合蛋白亲和色谱法 原理：首先将“诱饵”蛋白吸附在相应的亲和柱上，当细胞抽提液经过该柱时，与“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白被吸附，进一步利用洗脱剂将吸附的蛋白复合物洗脱进行鉴定。 （6）表面等离子共振技术 原理：利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。 基本操作流程： （7）荧光共振能量转移 　　荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。 二、查阅相关资料，理清胰岛素与胰高血糖素对糖脂代谢的调控机理，以及两者之间的协作。 胰岛素调控机理： 胰岛素与其受体结合，激活受体络氨酸酶激酶，引起胰岛素受体底物的磷酸化，胰岛素受体磷酸化后，激活靶细胞细胞膜载体蛋白，使血液中的葡萄糖转运到细胞中；络氨酸磷酸化受体与信号分子通过共价修饰，增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度；通过激活HYPERLINK /s?wd=%E4%B8%99%E9%85%AE%E9%85%B8hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使HYPERLINK /s?wd=%E4%B8%99%E9%85%AE%E9%85%B8hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6丙酮酸脱氢酶激活，加速HYPERLINK /s?wd=%E4%B8%99%E9%85%AE%E9%85%B8hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6丙酮酸氧化为HYPERLINK /s?wd=%E4%B9%99%E9%85%B0%E8%BE%85%E9%85%B6Ahl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化；通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少HYPERLINK /s?wd=%E7%B3%96%E5%BC%82%E7%94%9Fhl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6糖异生的原料，抑制HYPERLINK /s?wd=%E7%B3%96%E5%BC%82%E7%94%9Fhl_tag=textlinktn=