各种显微技术——制片——染色概述.doc

形态学研究技术 显微镜介绍 （PPT 3~18） 固定 （PPT 19~20） 组织切片 （PPT 21~25） 组织染色 （PPT 26~30） 免疫组织化学/免疫细胞化学 （PPT 31~56） 荧光染料 （PPT 57~65） 定量分析 （PPT 66~77） 应用 （PPT 78~88） 电子显微镜 （PPT 89~102） 显微镜的介绍 ★四种光学显微镜：亮视野；相差；微分干涉相差；暗视野（用的非常少，比如原位杂交中同位素标记的点是亮的，用暗视野显微镜在暗背景下看到的亮点会更清楚） ★倒置显微镜：可操作空间大，可以做电生理等实验，最常用的观察方法是相差，由于此方法不需要染色，因此是观察活细胞的理想方法，分辨率不如正置 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 ★体视显微镜：视野大可作精细解剖和/或胚胎，分辨率不如正置 1． 双目镜筒中的左右两光束不是平行的，而是具有一定的夹角——体视角（一般为12度---15度），因此成像具有三维立体感； 2．像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故； 3．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长 4．焦深大，便于观察被检物体的全层。 5． 视场直径大。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为汞灯紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人目。 （荧光素的标记只是作为一种指示剂，不像电子显微镜下面看到的是真实物体，要真正敲定某种物质的location只能借助电镜） ★共聚焦显微镜：（结构，原理）光源不是汞灯,是激光器，（注：在观察的时候，使用汞灯为光源，拍摄的时候使用激光器）与普通的CCD成像不同, 普通的CCD成像杂光多，不清晰，颜色是真彩,共聚焦显微镜的颜色是伪彩（同一个激光器有几个不同的波长，可据荧光素选择具有需要波长的激光器。不同于普通荧光显微镜激发光是某一波段内的光，激光器发出的是某一特定波长的光，能量集中，功率大。） 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(Pinhole)，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 ★成像系统 digital camera imaging system(CCD)（真彩） CCD的真实名称为电荷耦合器件，工作原理是CCD将光线转换成模拟电压信号，并且标出每个象素的灰度级，再由一个模数转换器将模拟电压信号转换为数字信号，每种颜色使用8、10或12位来表示，逐点扫描后，通过扫描图像专用格式保存在电脑里。成像过程中，光源发出的光必须经过镜片的反射和透镜的聚焦，且得到的图像是真彩。 共聚焦成像-----激光共聚焦显微镜（伪彩） 有小孔，分辨率高，但进入的光量也少，需在两者间达到平衡；不是CCD那种全量，而是只扫描某个部分，得到的pic 每张都在焦点上，可以叠加；得到的灰白pic可以人为赋予各种颜色。 固定 ★ 固定的目的和作用 若想得到理想的染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好的酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（immobility）和免疫活性也是至关重要的。 固定的目的在于迅速终止酶的活性，避免组织细胞结构的解体，阻止细胞内外肽类和蛋白质的扩散移位，增强组织细胞对标本制作过程中各种有害影响的对抗作用，总之，在于达到固定抗原和保存组织细胞形态结构的目的。尤其是保持抗原分子上有限数目氨基酸顺序和抗原决定簇的完整性，保持抗原分子三维空间构型的稳定性以便于结合特异性抗体。尤其是大多数神经激素和肽类物质，因为具有水溶性，在进行免疫组织化学研究之前，常常需要固定处理。但是肽类物质和蛋白