质粒DNA的转化。分析.pptVIP

实验三 质粒DNA的转化  实验目的 掌握CaCl2法将载体(质粒)转化入受体 (大肠杆菌)的实验技术 实验材料 受体:大肠杆菌DH5α 载体: pUC19  pUC-19 Vector  实 验 原 理 抗生素平板选择标记  pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，而宿主菌DH5α对氨苄青霉素没有抗性。在用 pUC19质粒转化DH5α后，涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培养，没有被转化的菌不能生长，而被转化了的菌可以正常生长，形成菌落。 β-半乳糖苷酶系统筛选（蓝、白斑筛选） pUC19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段, 其中含有β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。 DH5α宿主菌染色体上带有LacZ的C端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性, 但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来, 形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。质粒载体与LacZ基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用称为α互补。 Lac操纵子调控模型 α-互补 正常的β-半乳糖苷酶 α-肽 C端部分 有活性的β-半乳糖苷酶 不能互补 α-肽中加了一段外源基因产物 C端部分 实验流程 制备感受态细胞 培养大肠杆菌 选择培养基平板的制备 质粒DNA的转化 配选择培养基平板 1. LB液体培养基: 1g蛋白胨, 0.5g酵母粉, 1g NaCl, 加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。（每组配40ml）2. LB固体培养基: 在40ml未高压灭菌的LB液体培养基中加1.5％琼脂，高压灭菌后取出。当培养基冷却到约50℃时，加入氨苄青霉素母液，使其终浓度为60μg/ml，摇匀后迅速倒成两个平板。（高压灭菌同时也灭菌两套洗净的培养皿）。 实验步骤 3. 在超净工作台上，往倒好的平板培养基上涂布44μl X-gal（80mg/ml）和IPTG（200mg/ml）混合液（10:1），将平板置于室温放置3-4h直至液体被吸收。 制备感受态细胞 1.取大肠杆菌DH5α划线培养过夜的单菌落接种到20mlLB液体培养基中，置37℃摇床于280rpm振摇培养约4h。 2.将细菌转移到一个无菌离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。 3.以4000rpm离心10min，回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培养液尽量流尽。 4.以1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，放置于冰浴。 5.以2000rpm离心10min，回收细胞且使培养液流尽。 6.取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，将细胞分成200μl一份，装入Eppendorf管中，置4℃冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。