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四、目的基因的检测与鉴定 导入过程完成后,全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗? 1 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 2 目的基因进入受体细胞后,是否都能稳定维持和表达? 不一定,需要检测 1、鉴定——分子水平的鉴定 转基因生 物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N (1)检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因 基因探针: 放射性同位素等标记的DNA分子 方法—— DNA分子杂交技术 变性 变性 1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 一、目的基因的获取 1 目的基因主要是编码蛋白质的基因: 如:与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。 2 获取目的基因的常用方法: 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 1. 从基因文库中获取目的基因 1. 基因文库的概念: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的 群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 2. 基因文库的种类: 基因组文库:含有一种生物的全部基因 部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因, 如:cDNA文库 基因文库的构建方法 ① 基因组文库的构建 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 重组载体 基因组文库 导入受体菌中储存 ② cDNA文库的构建-----逆转录法: 提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组载体 与载体连接 cDNA文库 反(逆)转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 基因组DNA文库与cDNA文库 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 限制酶 与运载体连接导入 基因组文库 cDNA 反转录 受体菌群体 与运载体连接导入 cDNA文库 某种生物某个时期的mRNA 思考? 真核生物的基因用逆转录法得到cDNA与原基因相同吗? 基因的结构 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 启动子 原核 真核 真核细胞的cDNA的获取 编码区 非编码区 非编码区 DNA聚合酶 剪接有关的酶 RNA聚合酶 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 逆转录酶 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码序列。即不含非编码区和内含子 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子(具有启动作用的DNA片段) 基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段) 基因多少 物种间的基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 怎样从基因文库中获取我们所需的目的基因呢? 根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 思考? 2.利用PCR技术扩增目的基因 1 概念: PCR全称为_______________,是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 2 原理:DNA复制 原料:模板DNA;DNA引物;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 3 前提: 已知目的基因的一段核苷酸序列 PCR技术的操作过程 a、DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下,_____断裂,形成________ b、退火(复性55℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部________。 c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 d.重复a.b.c步骤:每重复一次,目的基因增加___倍 一 PCR技术扩增与DNA复制的比较 DNA复制 PCR技术 场所 原理 条件 解旋方式 酶 特点 结果 碱基互补配对原则 碱基互补配对原则 四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP 四种脱氧核苷酸
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