外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测分析.pptxVIP

实验八：GFP在大肠杆菌中的诱导表达和检测 ;一．实验目的;二．原核表达的一般流程;原核表达：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： ——易于生长和控制； ——用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； ——有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 ——但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 ;表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： ——选择标志的编码序列； ——可控转录的启动子； ——转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； ——一个多限制酶切位点接头； ——宿主体内自主复制的序列。 ;pET载体系统;将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经SDS检测。 ;;SDS分离蛋白原理;SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。;演 示 文 稿 1 2 3 后 等;四．实验材料;五．实验步骤;2．目的蛋白的检测 （1）凝胶制备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30~40min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。 （2）凝胶电泳 取80 ml 电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒压20分钟，120V恒压2小时 （3）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.5~1 小时；之后，在脱色液中脱色1小时，观察目的蛋白表达情况。 ;五．注意事项;思考题