生物制药技术第三动物细胞工程制药(,,)分析.pptx

第三章 动物细胞工程制药;第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式; 一、动物细胞大规模培养的方法; 它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞)，也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养(perfused culture)，因此细胞密度一般较低。目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。如英国的Wellcome公司采用8000 L的搅拌罐式生物反应器培养Namalwa细胞大量生产α-干扰素。英国的Celltech公司则用2000 L的气升式生物反应器大量培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。; 2. 贴壁培养;生产疫苗中早期一般多采用转瓶大量培养原代鸡胚或肾细胞。近代有些生物制品的生产仍在采用这种方法，为减少劳动强度，采用了计算机自动控制的方法。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常会出现梯度式不均一现象，故放大常受到限制。 贴壁培养与悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩太培养时常常需要用酶将其从基质上消化下来，分离成单个细胞后再进行培养。; 3. 贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养; 微载体培养(microcarrier culture);后又经过多人的努力，到20世纪80年代这种方法已被正式用于工业化生产各种疫苗和其他细胞产品，并出现了-大批商品化 的微载体(表3 -9)。我国的军事医学科学院、华东理工大学和中国科学院化工冶金研究所等单 位也先后制备成功一批葡聚糖类(MC-l型、CT-l型、CT3型)、聚苯乙烯类(SH-2型、PS-l型) 和胶原类(GT-2型)等微载体，用于生产干扰素、疫苗和尿激酶原等产品。;理想的微载体需具备如下一些条件:;⑤粒径在60~250μm(溶胀后)之间为好，并 要尽可能地均一，差异不大于20μm。这样有利于细胞均匀地分布在各微裁体表面。 ⑥具有良 好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体仁的生长情况。 ⑦基质的性质最好是软 性的，避免在搅拌中由于载体互相摩擦而损伤细胞。 ⑧可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌。 ⑨经简单的适当处理后，可反复使用。 ⑩原料充分，制作简便，价廉。; 20世纪80年代中后期，人们在原来的固体微载体(solid microcarrier)的基础上，又开发出 了被称为第二代的多孔微载体(porous microcarrier)或多孔微球，它的特点是极大地增大了供细 胞贴附的比表面积(如Biosilon聚苯乙烯微载体的比表面积为225 cm2/g，Cytodex-l葡聚糖微载 体为6 000 cm2/g，而多孔微载体Cytoporc的比表面积则高达2.8m2/g)，而且它同时还适用于悬浮细胞的培养。目前也已有多种商品问世(表3 -10)。它可分为两类:一类在载体内加入铁 等金属，使比重增加，适用于流化床反应器;另一类不加钛，比重轻，可与国体微载体一样，用于搅拌罐式生物反应器或气升式生物反应器。前一种载体已在美国Genetech公司用以大规模生产 t-PA，后一种已在中国用于尿激酶原的中试生产。;(2)包埋和微囊培养; 可以用于包埋细胞的载体材料大致有3类:①人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰胺、环 氧树脂、聚氨基甲酸脂、聚乙醇等。①糖类，如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰几丁质等。③蛋白质，如胶原、明胶、纤维蛋白等。但目前最普遍应用的主要是琼脂糖和海 藻酸钙凝胶。这些材料中有的是靠温度的改变而改变物相，如琼脂糖，在高温时融化成液态，低 于37~45 ℃时则凝固;有的是靠离子移变而改变物相，如海藻酸钙，在钠盐时它是液态，当与钙离子接触形成钙盐时则形成凝胶。;微囊的制备常常是在形成凝胶后，再用另一种电荷相反的材料与之作用，使在载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内的载体液化而成。目前使用最多、最成 熟的材料搭配是海藻酸钠-聚赖氨酸。由于聚赖氨酸很贵，因此人们又试验了许多其他材料的 搭配，也都取得了成功，我们采用国产的脱乙酰几丁质和海藻酸钠也成功地制备了微囊，并成功 地培养了CHO 工程细胞和杂交瘤细胞。; 包埋或微囊培养法的优点是： ①包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切 力的损害。 ②可以获得较高的细胞密度，一般都在107~108个/ml以上。 ③当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。有人报道用微囊培养杂交瘤细胞， 囊内的抗体浓度可高达1 250~5 300mg/L。 ④可采用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生物反应器，气升式反应器等。而包理法当其颗粒直径较大时