化学发光测定仪总结.ppt

发光免疫技术 发光免疫技术(luminescence immunoassay, LIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成为医学、生物学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。 化学发光的分类 酶促化学发光： 辣根过氧化物酶系统：丰汇、强生 碱性磷酸酶系统：贝克曼 非酶促化学发光： 吖啶酯系统：雅培 电化学发光：罗氏 闪光与辉光及其测量方式的差别 发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激发能可将发光分为三种类型: 1.光照发光 2.生物发光 3.化学发光。 1. 光照发光 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光 。 2. 生物发光 典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素 (firefly luciferin)，在荧光素酶(luciferase)的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化萤火虫荧光素 (oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。 3.化学发光 化学发光是在常温下经化学反应所产生的发射光。 化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量(即发光)。 化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物 酶促反应的发光底物 直接化学发光剂 电化学发光剂 1．酶促反应的发光底物 酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光底物为： HRP的发光底物 ：价格低廉、国内技术成熟 ALP的发光底物 ：价格昂贵、国内无成熟技术 (1) HRP的发光底物 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。 鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行。 （2）ALP的发光底物 常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。 AMPPD　 AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15~ 60min内光强度保持相对稳定。 2．直接化学发光剂 这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。 3.电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图19-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。 3.电化学发光剂 激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强 。 酶促化学发光免疫分析就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。 化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。 化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用化学发光免疫技术测定。其起步于80年代初，快速发展于90年代，在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃发展的阶段。 化学发光免疫技术具备以下特点 ： ①高度敏感，极限达10-17~10-19M/L，远高于RIA、EIA、TRFIA。 ②特异性强，重复性好C.V.＜10％。 ③测定范围宽，可达7个数量级。 ④试剂稳定性好，无污染有效期6－12月。 ⑤操作简单，易于自动化。