分子生物学基本技术程序.ppt

聚合酶链反应 (polymerase chain reaction; PCR) PCR：在体外由引物(primers)介导,利用酶促反应获得特异基因组DNA或cDNA的专门技术，又称基因扩增技术。 反应体系的基本成分：模板DNA、 引物、四种dNTP、耐热性DNA 聚合酶、以及含有Mg2+的缓冲液 酶切位点的引入 限制性酶切位点在引物的5‘端的顶端 最好利用引物本身的碱基，减少引物的长度 Tm控制在55-58以上，避免发卡、二聚体及非特异性等问题 酶切位点的加入保护性碱基3-6个（可以查阅） 上下游引物的酶缓冲体系尽量一致 相邻的两种酶切位点不能同时选用 RT-PCR 以总RNA、mRNA为模版，经反转录生成cDNA 以cDNA为模板，经PCR合成大量目的基因片段 ? 　 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。 ? Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 反应原理 引物序列 Upstream: 5-GAGAGTCCATGGCCTCAG-3 Downstream: 5-GCAAGTCAAGCTTTATTCACTCTG-3 突变体引物设计： 酪氨酸突变成天冬氨酸（D）：GAT, GAC T1 ：5-GTTATACCACTCGTCGGGACTAAACCTGGCTATGACAAAG-3 5-GCCAGGTTTAGTCCCGACGAGTGGTATA-3 T2 ：5-GGGTTGCAAGGGTGTGGGTTGTCCCACTCATAGGG-3 5-CCCTATGAGTGGGACAACCCACACCCTTGCAACCC-3 T3：5- TTTGGATTTGTCTAAAAACTCTCCCACTGC-3 5-GTGGCAGTGGGAGAGTTTTTAGACAAATCCAA-3 T123（以T3 为模板） 5-GGGTGTGGGTTATCCCACTCATCGGGACTAAAC-3 5-TTAGTCCCGATGAGTGGGATAACCCACACC-3 酪氨酸变成谷氨酸（E）GAA, GAG T1 ：5- GTTATACCACTCTTCGGGACTAAACCTGGCTATGACAA-3 5- GCCAGGTTTAGTCCCGAAGAGTGGTATA-3 T2：5-GGGTGTGGGTTCTCCCACTCATAGGGACTAAACC-3 5-GTTTAGTCCCTATGAGTGGGAGAACCCACACCC-3 T3：5-TGGATTTCTCTAAAAACTCTCCCACTGC-3 5-GTGGCAGTGGGAGAGTTTTTAGAGAAATCCAAA-3 GluR6突变体引物设计：天冬氨酸GAT, GAC Y587D： T1up：5’- GCCAGGTTTAGTCCCGATGAGTGGTATAACCC-3’ T1down：5’- GGGTTATACCACTCATCGGGACTAAACCTGGC-3’ Y590D： T2up：5’-GTCCCTATGAGTGGGATAACCCACACCCTTGC -3’ T2down：5’- GCAAGGGTGTGGGTTATCCCACTCATAGGGACT-3’ Y844D： T3up：5’-GTGGGAGAGTTTTTAGACAAATCCAAAAAAAACG -3’ T3down：5’-CGTTTTTTTTGGATTTGTCTAAAAACTCTCCCAC -3’ GluR6突变体引物设计：谷氨酸（E）GAA, GAG Y587E： T1up： 5’- GCCAGGTTTAGTCCCGAGGAGTGGTATAACCC-3’ T1down：5’- GGGTTATACCACTCCTCGGGACTAAACCTGGC-3’ Y590E： T2up：5’-GTCCCTATGAGTGGGAAAACCCACACCCTTGC -3’ T2down：5’-GCAAGGGTGTGGGTTTTCCCACTCATAGGGACT-3’ Y844E： T3up：5’- GTGGGAGAGTTTTTAGAGAAATCCAAAAAAAACG-3’ T3down：5’-CGTTTTTTTTGGATTTCTCTAAAAACTCTCCCAC -3’ 基因测序技术 Southern blot:将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上 基因芯片技术 原位杂交 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 优点：不需要把检测的核酸提取出来 快速、高通量、平行化、自动化