中药成分对TGEV体外抑制作用及机制初步研究.docVIP

摘 要 猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引发的一种高度传染性猪疾病。该病毒感染可导致仔猪严重腹泻、厌食、呕吐、脱水、无力，两周龄以下仔猪死亡率更高，是危害养猪业的重要病毒之一[1]。为了探讨连翘苷等中药成分如何在猪面对传染性胃肠炎病毒能够发挥出怎样的作用与机制，明确中药成分如何在体外作用并成功达到抗病毒的疗效，本研究利用动物细胞培养技术，采用MTT比色法和细胞病变观察法相结合，筛选出抗TGEV活性较好的中药成分，将抗TGEV中药成分不同作用方式下在ST细胞上与病毒结合，根据细胞形态及病毒量的变化，明确中药材内抑制TGEV增殖整个完整的作用过程原理。同时对筛选出的中药成分进行复方组合，观察复方中药成分对TGEV的作用疗效，为抗TGEV的药物筛选提供依据。主要研究内容包括： 1. 药物活性筛选细胞模型的建立 对长满单层ST细胞的感染TGEV强毒株病毒，当细胞出现明显的病理变化时，采取通过RNA提取试剂盒来获得细胞病变后的总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒生成新的cDNA，以所获得的cDNA作为PCR技术采用的模版进行DNA的复制与合成，经琼脂糖凝胶电泳，扩增出了条带大小约0.75 kb的特异性片段，没有超出最初设想的条带规模。并进行TGEV测序同源性分析。把TGEV培养液稀释十倍以上，依次接种到布满单层ST细胞的96孔板上，设置对照组，培养72 h，并对细胞病变情况进行每天记录。根据Karber法[2]计算病毒半数组织细胞感染量为10-6.25/0.1 mL，用细胞维持液配成100?TCID50病毒悬液，-70℃冻存备用。这些步骤保证了能否完美创立筛选抗病毒中药成分的细胞培养模型。 2. 抑制TGEV增殖中药成分的体外筛选 将各中药成分在最大允许的浓度范围内连续2倍倍比稀释后，依次采用先感染病毒再配药、先配药后进行病毒感染、药和病毒混合后感染ST细胞三种方法来体外增殖抑制试验，通过酶标仪测得630 nm处OD值，计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率，筛选出抗TGEV活性较好的中药成分，并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度，6种中药成分与病毒作用后，分别测定TGEV的病毒滴度并进行分析比较、RT-PCR鉴定各个药物成分对病毒RNA合成的抑制效果。结果表明：6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有达到有效的增殖抑制效果，此中咖啡酸直接杀灭病毒效果最显著。了解了中药成分抗病毒的作用方法为进一步认识中药抗病毒的治疗原理机制做了铺垫。 3. 复方中药成分对TGEV的增殖抑制作用 对2中筛选的最佳抗TGEV浓度的中药成分进行复方组合，第一组：连翘苷和连翘苷元；第二组：连翘苷和咖啡酸；第三组：连翘苷元和咖啡酸；第四组：以上三种全部物质。将抗TGEV最佳浓度的中药成分复方组合后与病毒混合后感染细胞，设置正常细胞对照组，病毒对照组，每组设置3个重复，通过酶标仪测得630 nm处OD值，计算出各组复方中药成分分别对TGEV的抑制率，6种中药成分与病毒作用后，测定TGEV的病毒滴度并进行比较分析，结果表明复方中药成分抑制TGEV增殖作用如下：连翘苷、连翘苷元和咖啡酸组连翘苷和咖啡酸组连翘苷元和咖啡酸组连翘苷和连翘苷元组。本研究为抑制TGEV的药物筛选提供理论基础，为中成药物的研制开发了新的思路。 关 键 词：猪传染性胃肠炎病毒，ST细胞，中药成分，咖啡酸，连翘苷。 第1章 文献综述 1.1 猪传染性胃肠炎的研究进展 猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)是引发猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)的高度接触性病原，其隶属于套式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，是致使仔猪病毒性腹泻的主要病原之一，由其带来的猪传染性胃肠炎以吐逆、脱水、严重腹泻、厌食无力和对10日龄以下乳猪造成的居高不下的死亡率为特点，死亡率高达90%-100%。该病能致使绝大多数乳猪失去生命，给选择猪为养殖对象的个体户造成的损失不可估量，国际上兽医局法典把该病认定成B类疫病传染病。1946年，Doyle和Hutchings[3]在美国对本病进行了首次公开声明，进一步研究表明其致病原因属于病毒。上个世纪60年代，在中国台湾、日本、英国养殖场相继发现本病毒，目前本病传播范围已经扩大到欧美等大部分国家和地区，在全世界范围内流行。直到1973年，在我国内陆第一次分离得到TGEV。 前几年，我国内陆多个省市相继发现了该病毒，近期，该病毒再次传播开来，