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荧光分光光度法 第一节 概 述 某些物质受到光照射时，吸收某种波长的光之后，会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停止照射，这种光线也随之消失，此种光称为荧光(fluorescence)。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光单重态和三重态：分子中的电子运动包括电子轨道的运动和电子的自旋运动。 分子中电子的自旋状态可用多重态 2S+1 描述，S为总自旋量子数。 若分子中没有未配对的电子，即S=0,则2S+1=1 称为单重态； 若分子中有两个自旋平行的未配对电子，即S=1，则2S+1=3称为三重态，用T 表示。 通常的情况下分子的电子处于最低的能级状态，用S0 表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能级跃迁到较高的电子能级，即激发态，用S1, S2……表示。 RLS 二. 金属螯合物的荧光 三. 荧光的熄灭 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 荧光分析法的应用 一. 工作曲线法 荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104. 荧光熄灭工作曲线法 Fx F Cs Cx 直接荧光标准曲线法 F Cs Fx Cx 二. 荧光分析法的灵敏度 * Modern Instrument Analytical Method 分子发光的基本原理 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液，呈现了极为可爱的天蓝色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫反射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。 一. 分子荧光的产生 单重态与三重态 S0 S1 T1 S2 紫外可见吸收 光谱 外转移 紫外可见共振荧光 光谱 内转移 荧光 系间窜跃 磷光 反系间窜跃 迟滞荧光 振动弛豫 ２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁回到基态 内 转 移:S2~S1能级之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级之间有重叠 反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 ~ S2 １. 辐射跃迁的类型 共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec 二. 分子荧光光谱 1. 荧光激发光谱与发射光谱 荧光均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。 A. 激发光谱 固定?em=620nm(MAX) ?ex =290nm (MAX) 固定发射波长 扫描激发波长 荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似 ?ex =290nm (MAX) 固定?em=620nm(MAX) 固定?ex=290nm (MAX) ?em= 620nm(MAX) B. 发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长 扫描发射波长 C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系 S0 4 3 2 1 S1 4 3 2 1 发射光谱的形状与激发波长无关： 分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→1 1 → 1 1 → 2 1 →3 1 → 4 2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的激发光谱 固定发射波长、扫描激发波长 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的发射光谱 固定激发波长、扫描发射波长 蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱 VB1和VB2的三维荧光光谱 RLS DS TS ATS ADS 散射片三维共振光散射光谱 3.三维共振光散射光谱 ADS ATS TS DS 散射片三维共振光散射等高线光谱图 共振光散射 瑞利散射 固定?ex=270nm 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射 荧光光谱有用区间 三. 分子荧光强度与荧光物质浓度的关系 1. 荧光强度与浓度的关系 光吸收定律（Lambert – Beer Law） 相应的吸光分数为： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比： 按照级数展开式： 对于稀溶液，当? bc0.05时： IF----荧光强度 ?F-----荧光量子产率 k-