【发酵工程】第二章_发酵工业菌种.ppt

* 生产抗生素。 * 醪糟（láo zāo * 稀释倒平板法（Pour Plate Method）又称：浇注平板法。先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。 * * 原核表达系统常用：大肠杆菌（E.coli），枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、链霉菌等 真核表达系统常用：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 蛋白质育种工程 寻找新的物种，再从中分离筛选新蛋白 或者对天然功能蛋白进行改造 体外蛋白质改造已经成为获得新功能蛋白质的方法。 蛋白质工程分为理性设计（定点改造、定向改造）和非理性的体外定向进化（随机化突变、定向筛选） 定点突变技术 定点突变技术是基于蛋白质工程的理论，以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新蛋白质的氨基酸序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。 改变蛋白质的一级结构 普遍用于菌种改良 定向进化技术 体外模拟自然进化过程，使基因发生大量变异并定向选择出所需性质和功能的蛋白质。 特点：依赖基因随机突变，建立突变体文库 方法：易错PCR；DNA随机重组（图2-8） 代谢工程的定义 利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。 又称作途径工程，是多基因的基因工程。 代谢工程育种思路 1. 改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。 （1）加速限速反应 （2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。 （3）构建代谢旁路 （4）改变能量代谢途径 2. 扩展代谢途径 （1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。 （2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。 3. 转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径: 为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。 2)构建新的代谢途径: 利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。 组合生物合成育种 通过合成化合物库进行高效率的筛选。 一次性同步合成成千上万结构不同的分子即组合库，然后进行生物活性测定和化合物结构鉴定。（图2-9） 反向生物工程育种 反向代谢工程针对限制生物活性的主要因素，在相关生物种类识别希望的表型，确定该表型的决定基因，通过重组DNA技术将该基因在需改造的生物中克隆表达出来。 策略：图2-10 关键：确定希望表型的遗传基础。 第四节 发酵工业菌种保藏 工业生产菌种的退化现象及原因 菌种退化（degeneration）主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的优良菌株，由于连续传代或保藏之后，群体中某些生理和形态特征逐渐退化或完全丧失（包括菌株产孢子能力、发酵主产物产量下降）的现象。 1、退化的表现 菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体变得小而少； 生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的橘红色分生孢子层； 抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱。 代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素能力下降； 2、退化的原因 1）基因突变　　 那些控制生产性状的基因发生负突变。 2）连续传代 3、菌种退化的防治 1）从菌种选育方面考虑　　 在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理； 在使单链突变的同时，使另一条单链丧失模板作用，以减少出现分离回复现象； 诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌株的“纯度”。 2）控制传代次数 如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌株，回复子的比例随传代次数的增加而增加，腺苷产量也随之下降。 3）创造良好的培养条件　　在进行栖土曲霉培养时，温度从28-30℃提高到33-34℃，可防止产孢子能力的衰退。 4）利用不易衰退的细胞传代　　 在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含有几个细胞核，若用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种