6. 荧光分光光度法.pptVIP

第6章.荧光分光光度法 6.1 概述 6.2 方法原理 6.3 荧光分析法 6.4 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用 6.1 概述 荧光蛋白质 在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁?沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。 用绿色荧光蛋白标记的细胞 用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体(细胞、细胞器)的标记。 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。 荧光染料 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。 用于增白洗衣粉中的增白剂， 指示信号用的各种荧光路标漆， 荧光标志服等。 荧光增白剂 它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有的黄光辐射互为补色成为白光，提高产品在日光下的白度。 6.2 方法原理 单重态 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。 大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 6.2.2.3 激发态→基态的能量传递途径 分子去活化过程及荧光的发生 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11～10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。 2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。（“内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间） 3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转移—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为? “荧光发射”。如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-9 ～10-7秒。（它代表荧光的寿命） 4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态)的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。 6.2.2.4 分子荧光的类型 分子因吸收光能而被激发，所产生的次级光发射现象称为光致发光； 荧光棒 荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物和荧光染料三种化学成分构成。荧光棒发光原理是过氧化物和酯类化合物发生反应后，能量传递至荧光染料，再由染料发出荧光。 发光机制是两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果 6.2.3 激发光谱与荧光光谱 1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(I)，作I—λ光谱图称激发光谱。 2. 荧光光谱：选择λex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录不同发射波长时的I，作 I- λ光谱图称为荧光光谱。 4. 荧光分析的定量基础 5.荧光物质 (二). 荧光与分子结构的关系 （2）共轭效应 ? →?* 跃迁 芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大. 3,4-苯并芘 刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基的影响 给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 与?体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光: 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧灯. 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中样品池用石英或低荧光的玻璃材料. 发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。 检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。精密的荧光光度计采用光电倍增管为检测器，将转入的光信号转变为电信号，并将其放大，由记录器记录荧