分子荧光(本)精要.pptVIP

2.激发态→基态的能量传递途径 蛋白质内源荧光 蛋白质在270-300nm有吸收，这种吸收主要来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，所以蛋白质具有天然荧光。当用280nm波长激发时，蛋白质大致有相同的荧光光谱，最大值在313nm和350nm处。前者恰与酪氨酸一致，后者恰与色氨酸一致，没有色氨酸的组蛋白只给出最大在313nm的荧光光谱，没有芳香族氨基酸的蛋白质不显示荧光。 6 分析方法1）定量分析 标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，测出各自的IF后，作出 IF — c 曲线或获得线性回归方程；在相同的条件下，测定样品的IF,x，得出样品的 Cx。 基线校正：为了使实验在不同时间所测得的数据前后一致，在测绘标准曲线时或在每次测定试样前，常用一个稳定的荧光物质的标液作基准校正。 标准对照法 若曲线通过原点，且完全符合浓度的线性范围，用标样对照测定试样的浓度表达式为： ? 仪器光路图 同步扫描技术 可获得三维光谱图的仪器 6.2共振瑞利散射光谱 一 共振瑞利散射的形成： 光散射是指光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的发光现象。介质分子由电子和原子核组成。光电磁波的电场振动导致分子中电子产生受迫振动形成偶极子。根据电磁理论，振动着的偶极子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。 光散射与介质的不均匀性有关。根据介质中粒子大小不同，散射可分为Tyndall散射和分子散射。当粒子的尺寸大于入射光波长(λ0)时发生反射并服从反射定律。如果介质中粒子直径(d )与入射光波长相近，便产生Tyndall散射；如果介质中粒子很小， d ≤0.05 λ0时便产生以Rayleigh散射为主的分子散射，分子散射比Tyndall散射弱得多。 二 共振瑞利散射的测定原理：在普通荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱(△ λ=0)即为散射粒子的散射光谱。 三 共振瑞利散射的应用 1核酸的分析 基于带正电荷的染料(如酞青染料)与DNA的磷酸根之间的静电作用导致染料在DNA分子上聚集，以及金属络合物和季铵盐类与DNA作用产生增加的共振瑞利信号，建立测定DNA含量的方法。 2蛋白质的分析 在静电作用为主的体系中，当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷。阴离子染料与蛋白质之间通过静电作用形成蛋白质-染料的复合物，染料在蛋白质分子上堆积形成较大的粒子，因而产生强烈的共振瑞利散射信号。利用此现象可对蛋白质进行分析测定。 3 溶液中蛋白质分子构象变化的推测 荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001?g/mL之间。可 见比UV-Vis的灵敏度高得多！ 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量 子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧 光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的 因素较多。 * 第5章 分子发光分析 （Molecular Luminescence Analysis） 5.1 分子荧光 一、基本原理 1. 分子能级、荧光及磷光的产生 2. 去活化过程 3. 定性分析 4. 影响荧光及荧强度的因素 5. 定量分析 二、荧光仪器 5.2、共振瑞利散射光谱 1. 瑞利散射的产生条件： 2. 瑞利散射强度的测定原理 3. 瑞利散射光谱在生物及医学方面的应用 5.1 分子荧光分析 特点： 灵敏度高（1-100ppb)：有的可达0.01ppb。荧光灵敏度除待测物浓度有关外，还与入射光强度及光度计灵敏度有关； 选择性好 方法简单快速，用样量少 应用不太广泛。 一、基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（ 紫外可见光 ）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出与入射光相同或较长的紫外可见光。所发光叫荧光或磷光。 1分子的基态与激发态 基态(S0)：分子中所有电子自旋是成对的，此时所处的电子能态称为单重态，也叫基态单重态。 激发态(S) ：当配对中某个电子激发时，受激电子的自旋仍针保持方向相反，称为激发单重态。 激发态（T）：受激电子的自旋方向与原来配对的电子保持平行，称为激发三重态。从基态单重态到三重激发态的跃迁属禁阻跃迁。 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(荧光或磷光)和无辐射跃迁（热）等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 荧光