11 第十一章 胚胎工程.pptxVIP

第十一章 胚胎工程;胚胎工程（embryo technology）是指对动物早期胚胎或配子进行工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。;第一节 体外受精动物（试管动物）;体外受精动物培育一般经过以下几个步骤：;一、精子采集与体外获能;最初通过在同种或一种雌性生殖道孵育精子获能，后来发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等再体外培养精子获能。 目前可以采用添加诱导精子获能物质（如钙离子、血清蛋白（BSA）、肝素等）的特定培养液来完成精子体外获能。 ;二、卵细胞回收与成熟培养;1. 成熟卵细胞（卵子）的收集 雌性动物超排卵后，将腹腔镜插入腹腔，观察到卵泡后用吸管吸出卵细胞。这种方法的关键是掌握卵细胞进入输卵管和卵细胞在输卵管中维持受精能力的时间。这种方法操作程序复杂，成本较高。由于超数排卵采集的卵细胞已在体内发育成熟，不需要成熟培养可直接受精。;2. 卵母细胞的收集、选择与成熟培养 （1）活体卵巢采集 借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。 对于牛和马等大家畜，常采用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导吸取卵泡中的卵母细胞。 这种手术方法简单省时，操作方便，可以反复多次采集。 ;（2）屠宰后家畜卵巢采集 从刚屠宰的母畜体内摘出卵巢，洗涤后保存在30-70℃的无菌生理盐水中，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵泡中的卵母细胞。也可对卵巢进行切片收集卵母细胞。摘出卵巢应在1-4h内收集。从废弃卵巢中采集卵母细胞关键是要注意卵巢的保温和防止微生物污染。;（3）卵母细胞的选择 采集到的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘-卵母细胞复合体。采集的卵丘-卵母细胞复合体要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围由多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把卵母细胞分A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围卵母细胞，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精中，一般只选择培养A级和B级卵母细胞。;（4）卵母细胞成熟培养 对采集的卵母细胞需要在体外模拟动物体内环境进行体外成熟培养，获得具有受精能力的成熟卵细胞。;3. 体外受精 精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵子膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶通过这些小孔释放出去，使卵子周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明。精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。;（1）共培养体外受精 一个卵子转至一孔或一滴受精培养液中，对于一些少精者可放入2-3个卵子。每孔（滴）中加入约10万条活动精子，快速置镜下检查精子浓度。置于5%CO2，37℃培养箱内培养。受精过程所采用的培养液与动物细胞培养类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛磺酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。 精子获能时间、精子添加密度、精-卵共培养时间、培养液pH和离子强度等对受精卵均有显著影响。通常受精后16-20h，卵子周围的颗粒细胞应当去除，倒置显微镜下观察卵子内出现两个雌雄原核，受精卵是否可以发育至囊胚是受精成功的标志。;（2）显微受精技术 显微受精是通过显微操作仪将哺乳动物精子注入卵子，使其在体外相互结合的技术。 ①透明带下注射法 用显微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精。优点是对卵子的损伤小，但是存在多精受精问题。 ②卵浆内精子注射法 用显微注射器将单个精子注射到卵子的细胞质内使卵子受精。避免多精受精。本方法对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要求 ③透明带修饰法 人工破坏卵子的透明带，使精子比较容易地通过破损处进入卵子完成受精。对于有一定运动能力但是顶体反应不全，无法穿过透明带的精子这种方法比较适用。优点是对卵子的损伤小，但易造成多精受精，影响胚胎继续发育。;4. 胚胎培养;5. 胚胎移植;（1）手术法 小家畜采用手术法移植。将同期发情的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，借助内窥镜观察排卵和黄体发育情况。腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，把胚胎输入子宫上1/3处。也可先用钝性针头在要移植部位刺一个小孔，然后把吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心将胚胎输入。这种方法移卵容易，卵损伤小，成功率高。创口用手术针线缝合，消炎并肌肉注射抗菌素。 （2）非手术法 对于牛马等大家畜用专用输胚枪直接插入子宫角内注入胚胎。;第二节 试管婴儿;一、试管婴儿的三种类型;二、试管婴儿培育技术;（一）超排卵、取卵与成熟培养;（二）精子采集与获能处理;（三）体外受精;（四）胚胎培养（受精卵体外培养