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蛋白质检测工艺之 SDS凝胶电泳 2013年复旦生物工程硕士基因工程实验技术系列讲座之 实验原理 电泳:带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 PAGE:聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS） 光聚合（核黄素）、化学聚合（TEMED） SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 SDS基本原理 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。 SDS基本原理 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW = K - bm 分子量判定 分子量判定 浓缩胶（大孔胶） 浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly 解离度 ：Cl 蛋 Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 浓缩效应 浓缩效应和分子筛效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动。 浓缩效应 浓缩效应和分子筛效应 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.9 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 分子筛效应 浓缩效应和分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 分子筛效应 浓缩效应和分子筛效应 电泳装置 滤纸 电泳梳 操作方法 １、安装玻璃板夹心 1)分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条上）。 2)红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。 3)将玻璃板夹心置于制胶架上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。 1）分离胶的制备 将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。约10-30 min凝胶完全聚合.将上层的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。 2、凝胶的制备 2）浓缩胶的制备 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，然后插入样品槽模板。静置10-20 min左右，浓缩胶即可聚合，垂直向上轻轻取出样品槽模板，装入电泳槽即可加样。 操作方法 标准蛋白质样品 中分子量标准蛋白试剂盒: