生物样品前处理重点.ppt

Enter presentation date 第二章 生物样品前处理 Test 第一章 绪论 第一节 样品分离的预提取（前处理） 2.1.2.1 植物组织中酶的提取 例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取 2.1.2.3 细菌重组蛋白的提取 例：E. coli.中提取重组蛋白 2.2.2 常用破碎方法 特点： 2.2.2.2 高速匀浆法 特点 增大压力和破碎次数，对于高浓度的细胞或难破碎的细胞常采用多次循环操作的方法 30～60Mpa最佳 易造成堵塞的团状或丝状真菌不适合 较小的革兰氏阳性菌（细胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不适合 2.2.2.3 超声破碎法 特点： 2.2.2.4 酶溶法 自溶法 2.2.2.5 化学渗透法 微波加热法：热运动使液态水气化，冲破细胞壁。 应用 Anhui University of Technology and Science Teaching?and?Research?Section · Department of Biochemical Engineering * 赵 世 光 现代生化分离技术 Separation Methods in Biochemistry 第二章 生物样品前处理 第一节 样品分离的预提取 第二节 细胞的破碎与分离 前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除； 2.1.1 概述 预处理材料的种类和特点 动物细胞反应液 植物细胞反应液 微生物细胞反应液 植物组织提取液 动物组织提取液 “发酵液” “产物”，胞内or胞外？ 组织 2.1.2 植物组织提取物的制备 植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。 叶片、根、茎——清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4°C —— -30°C低温保存备用）； 种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等——泡涨，粉碎。 一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。 1. 步骤： 100g新鲜叶片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（稳定酶活性）→PVPP预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→间歇高速搅拌（充分接触混匀）→纱布过滤→滤液加入PVPP重复轻搅（重复一次）→离心去除PVPP→酶粗提液。 2. 条件讨论 低温（4～5度），器皿、溶液预冷、操作要快； 5～7倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）； PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点； PVPP优良，不溶性； PPO抑制剂，DTT、2-ME； 蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。 2.1.2.2 多糖提取 重要活性多糖 步骤：原料→粉碎→醇醚回流脱脂→水提取→粗提液 去蛋白策略：Sevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性 TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。 重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。 1. 步骤： 酶解菌体细胞：离心收集菌体→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→电泳检测； 清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解； 溶解包涵体：释放目的蛋白； 目的蛋白再折叠：恢复活性 第二节 细胞的破碎与分离 微生物代谢产物： 胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等） 胞内产物（大多数蛋白质、类脂） 微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。 2.2.1 概述 机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等；对物料的挤压和剪切作用 非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等； 2.2.2.1 珠磨法 原理： 进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝d1mm）一起快速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。 玻璃珠（石英砂、氧化铝等研磨剂）+ 细胞悬浮液→研磨→释放胞内物 破碎过程产生热能，要注意热交换，温度控制——夹套冷却，实验室预冷器皿； 适用于绝大多数微生物细胞的破碎 高破碎率，但难以实现固液分离，浆状 高压匀浆器； 细胞悬浮液受高压作用→快速从针形阀射出→经历剪切、碰撞、高压至常压变化后导致细胞壁和细胞膜的破坏→释放胞内物 原理 可听波（次：地震、海啸）20~20KHz（超）。 空化现象指超声波在传播过程中与组织中