山东大学研究生国家精品课程_PCR原理及应用.pptVIP

聚合酶链反应Polymerase chain reaction（PCR）  概 述 聚合酶链反应（PCR）是一种在体外扩增特定基因或DNA序列的方法，又称基因体外扩增法，具有特异性、高效性和高度准确性三大特点。 发展简史 常规多聚酶链反应 常用的几种PCR技术 PCR的应用 一、发展简史 1985年：美国PE-Cetus公司的Mullis首次发明了PCR技术，采用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段 1988年初：Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR反应 1988年：Sarki 利用从水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus)中提取的耐热DNA多聚酶----TaqDNA多聚酶进行PCR研究 二、常规多聚酶链反应 （一）基本原理： PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。 变性----退火----延伸----延伸 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：dsDNA ssDNA ②模板DNA与引物的退火(复性)：引物与模板DNA的互补序列配对结合 ③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 新链又可成为下次循环的模板, 经2-3h可将待扩目的基因扩增放大几百万倍 PCR反应的DNA扩增量呈指数上升, 最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，则 Y＝2n 。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” 。 产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，即待扩增的特定片段。 以两条互补的DNA为模板，引物是从3‘端开始延伸， 其5’端是固定的，这种新生链作为模板时，由于5‘端序列固定，就等于再次延伸片段的3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的产物。 特异性强：由引物与模板DNA的特异性结合、碱基配对原则、Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性及靶基因的特异性与保守性决定 灵敏度高：皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平 操作简单，省时：1-2 h 对原始材料质量要求较低 有一定程度的单核苷酸错误掺入 （三）参与PCR反应的成分 模板：可为DNA或RNA，哺乳动物基因组DNA模板量为0.1-1?g 引物：0.1-0.5 ?mol/L 缓冲液：10-50mmol/L Tris-HCl（PH8.3-8.8） Mg2+浓度：1.5-2 mmol/L dNTP：单核苷酸浓度50-200 ?mol/L TaqDNA聚合酶：100?l 反应液中加入1-2.5U 的TaqDNA聚合酶 dNTP的质量与浓度 dNTP溶液呈酸性，pH7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。 dNTP浓度：50～200umol/L。 4种dNTP要等摩尔配制，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引起错配。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 PCR引物的设计原则 上游引物与目的DNA５’端序列完全相同； 下游引物与目的DNA３’端序列互补 引物长度以15-30个碱基为宜；引物碱基尽可能随机分布，G+C含量为40-60％ 避免引物内形成二级结构，尤其是发夹结构 两引物间不应发生互补，特别是在３’端，避免形成引物二聚体 两引物间不应有同源序列，与模板DNA的其它序列也不应有同源序列 引物的3’末端碱基原则上要求与模板DNA一定要配对 合成的引物应进行纯化 引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 ?mol/L 引物的5’末端可以进行修饰 引物的设计范例 目的DNA：５’－ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-----------------CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3’ 上游序列：５’－ ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC －３’ G+C=11/21=52% 下游序列：５’－CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3’ G+C=10/21=48% （四）PCR反应的条件 预变性：94 ℃ 3min左右 变性温度与时间：9