IVF实验室的基本操作.pptVIP

慢冻速融法 冷冻程序 20℃→－7℃ 3℃/min -7℃ 人工植冰 -7℃→－30℃ 0.3℃/min -30℃→－120℃ 30℃/min 胚胎复苏 1 2 3 4 0.5M丙二醇 0.2M蔗糖 5min 0.2M蔗糖 5min PBS 5min 1.0M丙二醇 0.2M蔗糖 5min 预防冰晶的再形成 复苏程序： 室温 40s→ 30℃水浴 1min 胚胎冻融损伤 复苏胚胎评价：50%卵裂球完整 存活 复苏率90% 无损伤胚胎着床率高 部分损伤胚胎着床能力下降 玻璃化冷冻 原理 条件：高浓度冷冻保护剂 极快的降温速度 载体：开放式 密闭式 适应症：卵母细胞 囊胚 优点：复苏率高 其他技术-IVM 未成熟卵母细胞体外成熟（IVM） 优点：简便 经济 避免OHSS 体外培养24-48h IVM培养液 IVM临床效果评价 新鲜移植 临床妊娠率 流产率 累计妊娠率 安全性？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * IVF实验室的基本操作 实验室操作原则 防止 污染 配子标本的标记； 受精、胚胎移植； 两人核对 毒性测试； 培养液、耗材的使用； 实验室的质量控制和管理 无误 无菌 无毒 辅助生殖技术基本操作 配子、胚胎培养系统 1 配子的收集和处理 2 体外受精技术 3 胚胎培养和移植 4 胚胎冷冻和解冻 5 培养液的准备 培养液的基本组分 无机盐离子---维持pH和渗透压 碳水化合物---能量来源 蛋白质来源 抗生素 矿物油 有利于维持培养液温度、pH值和渗透压稳定 防护屏障，减少污染 吸收脂溶性毒素 防止液体蒸发 培养液的准备 取卵前一日下午进行 原则：高效、方便、安全、经济 四孔培养皿—卵 处理精液所需培养液 微滴培养—受精卵、胚胎 胚胎移植液 37 ℃， 5% 或 6%CO2培箱内 平衡过夜 卵母细胞的获取 注射hCG后36-38小时取卵 阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡 核对姓名 解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物OCCC 37℃, 5－6%CO2 培养 操作迅速，避光 精液处理 正常精液：同IUI 极度少精：增加离心力 死精症：低渗肿胀实验 附睾穿刺精子： 睾丸穿刺或活检精子： 1ml注射器针头挑碎组织，离心悬液 附睾、睾丸精子的冷冻 常规受精 取卵后4-8h 适应症：精液正常， 轻度少、弱精症 受精率：65－80％（MII卵） 受精时间：长受精、短受精 卵母细胞浆内单精子显微注射 适应症：严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往IVF常规受精失败史、某些不明原因不孕等 时间：取卵后2小时 剥卵：利用透明质酸酶（80mIU/ml)和机械法剥除颗粒细胞 卵母细胞浆内单精子显微注射 卵母细胞成熟度的评价 GV MI MII 卵母细胞浆内单精子显微注射 操作滴的准备：7％PVP 加精 装针 显微注射 受精率：70％ 受精方式的选择 ICSI的安全性？ 逃避了自然选择过程 垂直传递遗传缺陷 操作过程对配子的损伤 严格掌握ICSI适应症 非男性因素不孕ICSI治疗结局 非男性因素不孕症，ICSI未显现出优势 检查受精 时间：受精后15－18小时 机械法除去颗粒细胞及放射冠 正常受精：两个原核，两个极体 合子形态评价 原核的大小、位置及方向 核仁前体的数目、大小、分布 胞浆的外观 早期卵裂情况 异常受精－1PN 发生率 1－5％ 卵裂率 74% 染色体二倍体率 5％ 囊胚形成率 29% (Noyes 2008) 机制： 雌雄原核发育不同步 雌雄原核融合 孤雌来源 ICSI多见 异常受精－多PN 发生率：IVF 5-8% ICSI 1% 发生机制： 2精子进入 第2极体滞留 双倍体卵母细胞 未见原核－未受精 可能机制 卵母细胞未成熟 卵母细胞染色体异常 卵裂率 10% 染色体二倍体率 3% 优胚率低 (12/38) 囊胚形成 (0/12) (Noyes 2008) 受精失败 受精率20% 受精率低下 所有成熟卵均未受精 受精失败 常规受精周期 失败率 10％ 精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍 补打ICSI? ICSI周期 失败率 2－3％ 严重精子畸形 卵母细胞激活 钙离子载体？机械激活？ 胚胎培养 胚胎质量评价 胚胎评价标准 细胞数 碎片: