PCR原理与应用.pptxVIP

PCR原理与应用 Principle and application of PCR;;PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。;; 单、双链DNA均可，一般为双链。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。; 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;;变性;PCR扩增原理;;延伸。。。;1）不对称PCR(asymmetric PCR) 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究;2）、逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大易于检测。 RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。 ;RT-PCR图解;;;5）、随机引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在PCR基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链(通常为十聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色来检测扩增DNA片段多态性。可用于进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。 ;;7）、单链构象多态性PCR (single strand construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同，其二级结构有所差异，PCR产物常表现???非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同。通过比较DNA的电泳类型，即可测出突变。其优点是所需样品DNA量极少，灵敏度高，可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选多个样品。 ;8）、多重PCR (multiplex PCR) 多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常(图8-5)。多重PCR具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交结果同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。 ;9）、实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR） 主要用于PCR产物实时监控。;生命科学;PCR技术在医学中的应用;检疫;法学鉴定;农业科学