分子荧光光谱法(去磷光)剖析.ppt

上图：用鼠抗golgin 97和兔抗COX IV分别作为一抗，用CF 488染料标记的山羊抗鼠IgG二抗和CF555标记的山羊抗兔的二抗染色的HeLa细胞。用CF647-鬼笔环肽标记微丝，并用Hoechest33342标记DNA。（其中绿色=高尔基体、红色=线粒体，蓝色=细胞核，紫红色=细胞骨架） 基于菁类荧光染料一种双模式粘度探针，在非粘性或者低粘度的溶液中，由于中位醛基的自由转动，消耗了激发能，染料的荧光淬灭；随着溶液的粘度增加或者温度的降低，荧光发射增强，并且长波长的荧光对粘度的敏感性高，表现比例增加，荧光比例值最高达到12倍，同时染料在长波长处的荧光寿命从不到200 ps增加到1450 ps。能更好地对细胞内复杂环境的粘度进行成像检测，这是以前的检测中是无法做到的。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （2）单组分的荧光测定 直接测定法：适用于有荧光的物质 间接测定法：适用于不发生荧光，或荧光量子效率很低物质。 利用化学反应使非荧光物质转变为荧光物质； 例：甾族化合物，经浓H2SO4处理后，使不产生荧光的环状醇类结构改变为能产生荧光的酚类结构。 荧光猝灭法，若被测物质具有荧光猝灭剂的作用，可测量荧光强度的降低来测定该荧光物质的浓度。 例：硼砂对姜黄素的荧光强度有显著的淬灭作用，可用于测定食品中的硼砂。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 无机化合物 利用金属离子，如铍、铝、硼、镓、硒、镁及某些稀土元素等，与有机试剂形成荧光配合物来进行荧光分析。 有机化合物 荧光分析可测定许多类有机化合物，在临床、生物化学和环境保护等领域中十分重要。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 几种常用的荧光试剂 试剂 测定的元素 安息香 B, Zn, Ge, Si 2,2’-二羟基偶氮苯 Al, F, Mg 2-羟基-3-萘甲酸 Al, Be 8-羟基喹啉 Al, Be 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。 待测物 试剂 λ exmax λemmax 测定范围 ppm 丙三醇 苯胺 紫外 蓝色 0.1~2 糠　醛 蒽酮 465 505 1.5~15 氨基酸 氧化酶 315 425 0.01~50 维生素A 无水乙醇 345 490 0~20 蛋白质 曙红丫 紫外 540 0.06~6 肾上腺素 乙二胺 420 525 0.001~0.02 青霉素 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽 420 500 0.0625~0.625 玻璃酸梅 3-乙酰氧基吲哚 395 470 0.001~0.033 胍基丁胺 邻苯二醛 365 470 0.05~5 四氧嘧啶 苯二胺 365 485 10-4 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （2）单组分的荧光测定 定量方法可采用标准曲线法。 首先测定一系列的标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度标准曲线，再测量试样的荧光强度，从而求得其浓度。 1. 荧光定量分析 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （3）多组分的荧光测定 利用荧光物质本身具有的荧光激发光谱和发射光谱，实验时可以选择任一波长来进行多组分的荧光测定。 若二组分的荧光光谱峰不重叠，可选用不同的发射波长来测定各组分的荧光强度； 若二组分的荧光光谱峰相近，甚至重叠，而激发光谱有明显差别，这时可选用不同的激发波长来进行测定。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （1）溶液中单分子行为的研究 2. 其它应用 分子荧光方法利用激光诱导产生超高灵敏度，这已能实时检测到溶液中单分子的行为。这一研究工作受到了广泛的关注。 目前，已观察到溶液中罗丹明6G分子，荧光素分子等及其标记的DNA分子的单分子行为。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （2）基因研究及检测 用溴化乙锭（EB）等荧光分子作为探针，通过探针荧光变化来研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前，典型的荧光探针分子为。 在基因检测方面，已逐步使用荧光柒料作为标记物来代替同位素标记，从而克服了同位素标记物产生的污染、价格昂贵及难保存等的不足。 2. 其它应用 携带荧光素酶的重组流感病毒IAV-luc 9月11日《Nature Communications》 可以通过检测活体动物肺部发光情况实时得知病毒感染情况，从而对同一动物体内的病毒感染进行连续、实时的动态监测。 双模式粘度荧光分子探针结构及在活细胞内的成像 （彭孝军，J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 6626-6635） 为设计生物荧光分子探针检测细胞或生物环境内的粘度提供了新思路，对一些心血管疾病的