理论3：聚合酶链式反应(PCR)及引物设计.ppt

现象：正对照有条带，而样品则无 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间? 现象： 1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致； 2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数?  对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数?  * 1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR的应用 3、DNA和RNA的微量分析： 　 PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测 　 RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平 5、基因突变分析： 　利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。 PCR的应用 聚合酶链式反应（PCR） 实验目的 1 实验原理（PCR及引物设计） 2 实验仪器、试剂及耗材 3 实验步骤 4 实验结果及讨论 5 实验仪器、试剂及耗材 实验仪器及耗材 PCR仪、移液器、0.2 mL PCR管、各种规格的吸头。 实验仪器、试剂及耗材 实验试剂 10×PCR buffer (Mg2+ Plus)（YRBIO）； dNTP mix (2.5 mM each) （YRBIO）； Taq DNA Polymerase (2U / μL) （YRBIO）； 引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液浓度为10 μM； Tpm4基因模板质粒: （购自YRBIO基因库）； 无菌超纯水； 琼脂糖。 聚合酶链式反应（PCR） 实验目的 1 实验原理（PCR及引物设计） 2 实验仪器、试剂及耗材 3 实验步骤 4 实验结果及讨论 5 实验步骤 准备PCR反应溶液，取0.2 mL PCR管，按以下顺序加入各试剂： PCR反应体系 无菌超纯水 38 μL 10×buffer 5.0 μL dNTP mix 2.5 μL 引物Tpm4-F 1 μL 引物Tpm4-R 1 μL 模板（ TS-Tpm4 ） 2 μL Taq酶 0.5 μL 合计 50 μL 实验步骤 调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。 反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 sec；55℃ 30 sec；72℃ 45 sec；30个循环，最后72℃延伸10 min。 每人做一管，反应完毕后，各取3-5 μL进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。 聚合酶链式反应（PCR） 实验目的 1 实验原理（PCR及引物设计） 2 实验仪器、试剂及耗材 3 实验步骤 4 实验结果及讨论 5 实验结果及讨论 PCR 产物琼脂糖检测结果 1、PCR产物（5ul样品） PCR常见问题 1. 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高 2. 非特异性扩增 PCR常见问题 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多 PCR常见问题 3. 拖尾 产物在凝胶上呈Smear状态 M 1 2 模板不纯或降解 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 4