土壤微生物的分离鉴定1.docVIP

土壤微生物的分离鉴定 培养基(culture medium)是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质,主要用于微生物的分离,培养,鉴定,菌种保藏或积累代谢产物等方面其种类很多,依微生物的种类,营养类型以及研究目的的不同而异,实验教学常用的有以下三种牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基.在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离,培养和测数等高氏一号培养基是一种合成培养基,常用于分离和培养放线菌马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基,常用于分离和培养多种真菌.1,药品和试剂:牛肉膏,蛋白胨,NaC1,10%NaOH溶液,10%盐酸溶液;可溶性淀粉,K2HPO4,MgSO4·7H2O,KNO3,NaCI,FeSO4·7H2O,琼脂.2,材料:新鲜马铃薯,蔗糖或葡萄糖3, 仪器：小铝锅,天平,牛角匙,1000mL刻度搪瓷杯,玻棒,pH试纸,分装漏斗,衣棉,橡皮圈,100 mL烧杯,标签纸,电炉,菜板,小刀,纱布,18mm×180mm试管 电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸头、试管、无菌水、土样称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取1mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，各种稀释度的土壤溶液。(一)牛肉膏蛋白胨培养基的制备1,培养基配方牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaC1 5.0g,琼脂20.0g,自来水1000 mL,pH7.02,操作步骤⑴ 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,加50 mL自来水,置电炉搅拌加热至牛肉膏,蛋白胨完全溶解⑵ 向小铝锅中加入500 mL自来水,将溶解的牛肉膏,蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1,在电炉上边加热边搅拌⑶ 加入洗净的琼脂条,继续搅拌,加热至琼脂完全熔化,补足水量至1000 mL⑷ 用玻棒沾少许液体,用pH试纸测定pH值.用NaOH或HC1调至pH7.0⑸ 分装漏斗分装于18mm×180mm试管中,塞好棉塞,装入小铁丝筐,然后用旧报纸将棉塞部分包好⑹ 高压蒸汽灭菌,121℃灭菌30min⑺ 分装到试管中的培养基灭菌后趁热摆放斜面(二)高氏一号合成培养基的制备 培养基配方可溶性淀粉20.0g,硝酸钾1.0g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯化钠0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,蒸馏水1000 mL,pH7.2～7.42,操作步骤⑴ 用搪瓷杯量取自来水500 mL置小铝锅中,在电炉上加热⑵ 根据培养基配方,依次称取各种药品加入搪瓷杯中,搅拌均匀.其中可溶性淀粉称入100 mL烧杯中,加入50 mL自来水调成糊状,待培养液沸腾时及如铝锅中,边加边搅拌,以防糊底⑶ 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至熔化,补足1000 mL水量,调pH7.2～7.4⑷ 趁热分装于18mm×180mm试管,斜面试管每管8 mL,若倒平板则每管装15 mL,装量根据需要而定⑸ 塞好棉塞,装入小铁丝筐,并用旧报纸将棉塞部分包好,贴好标签.⑹ 高压蒸汽灭菌,121℃灭菌30min⑺ 若有斜面试管,在灭菌后及时摆放斜面 (三)马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备1,培养基成分去皮的马铃薯200g ,蔗糖或葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000 mL,pH 自然。2,操作步骤⑴ 称取去皮新鲜马铃薯200g 切成1cm 见方小块放于小铝锅中,加1000m L 自来水,置电炉上煮沸20min 后,用双层纱布过滤.滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸⑵ 加入称好的蔗糖,琼脂,加热搅拌至琼脂完全熔化,并补足水量至1000m L⑶ 趁热用分装漏斗分装于18mm×180mm试管,斜面以8 m L为宜,柱状15m L为宜.分装完毕后做好棉塞,装入小试管筐并捆好,写好标签⑷ 高压蒸汽灭菌,121℃灭菌30min.若需摆斜面,灭菌后趁热摆成斜面??? (1)倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期??? (2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落??? (3) 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。微生物实验从09年3月份开始收集、查阅、整理、总结资料起，至5月份正式开